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公開番号2024156666
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024107218,2021203271
出願日2024-07-03,2015-09-17
発明の名称微生物を検出し同定するための方法およびデバイス
出願人ヒーリクスバインドインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】試料中の微生物細胞を単離する、検出する、かつ/または同定するための方法およびデバイスの提供。
【解決手段】試料から微生物細胞を単離し、試料から真核生物DNAを抽出し、かつ試料中の微生物種を同定するための方法およびデバイスが本明細書で開示される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解すること、ここで１つまたは複数の微生物細胞の溶解は、複数の微生物遺伝物質を放出させる；
複数の微生物遺伝物質を単離すること；
複数の微生物遺伝物質を増幅すること；
増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させること、ここで複数のＤＩＡＮＡは、配列番号１～３７からなる群から選択される配列を含む；
および
微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出すること、ここで結合の検出は、試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す
を含む方法。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
単離された複数のゲノム物質が精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることが、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、請求項１から２の１項に記載の方法。
【請求項４】
試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液が約０．２５％～１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％～０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６～９のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遊離の真核生物ＤＮＡが、約０．１Ｍ～０．８５Ｍの一価の塩濃度を有する約６～９のｐＨの条件下で陰イオン性－交換微小粒子を使用して血液反応から除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
試料が血液または痰である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の微生物遺伝物質を単離することが、微生物遺伝物質を陰イオン性－交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン－交換微小粒子を洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離された微生物遺伝物質がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せである、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年９月１７日に提出された米国仮出願第６２／０５１，４４７号の利益およびこれへの優先権を主張し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
政府支援
本発明は、国立保健研究所（ＮＩＨ）によって与えられた契約番号第Ｒ４３－ＯＤ０１６４６６号および第Ｒ４３ＡＩ１０９９１３号の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、読者の理解を助けるために提供される。提供された情報も引用された参考文献も本明細書で開示された組成物および方法への先行技術であると認められない。
血流感染（ＢＳＩ）は、米国における死亡の６番目に多い原因および最も費用が掛かる病院治療状態になるまで高まった。ＢＳＩは、全てのＩＣＵ利用の２５％および米国における全ての病院死のおよそ５０％を占める。ＢＳＩは、細菌または真菌によって典型的に引き起こされ、効果的な疾患管理には、それらの早期のかつ正確な同定が必要である。ＢＳＩは、典型的には、潜在的な病原体を同定するために最大数日かかる一連の血液培養を通して同定される。
分子診断法は、適切なタイミングで、非常に詳細な情報を介護者に提供する。感染症の場合、いくつかの病原体は、類似した病態生理学的症状をしばしば誘発するので、治療プロトコールを処方する際、感染病原体の同定が重要である。しかしながら、多くの病原体種は、決まって、治療の潜在的な諸ラインに対して大きく異なった応答を示す。
微生物病原体を同定するための分子診断法は、それらのそれぞれのゲノム物質中の保存された領域を探索することによって行われ得る。ゲノム同定のための方法は、病原性ＤＮＡの単離および検出を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様では、本テクノロジーは、対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することであって、複数の微生物遺伝物質を放出させる、溶解すること；複数の微生物遺伝物質を単離すること；複数の微生物遺伝物質を増幅すること；増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＮＡＩｎｖａｄｉｎｇＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）（ＤＩＡＮＡ）と接触させることであって、複数のＤＩＡＮＡが、配列番号１～３７からなる群から選択される配列を含む、接触させること；および微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出することであって、結合の検出が試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す、検出することを含む方法を提供する。
【０００４】
一部の実施形態では、単離された複数のゲノム物質は、精製される。
一部の実施形態では、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることは、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することであって、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、添加することを含む。
一部の実施形態では、試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液は、約０．２５％～１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％～０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、遊離の真核生物ＤＮＡは、約０．１Ｍ～０．８５Ｍの一価の塩濃度を有する約６～９のｐＨの条件下で陰イオン性－交換（ａｎｉｏｎｉｃ－ｅｘｃｈａｎｇｅ）微小粒子を使用して血液反応から除去される。
【０００５】
一部の実施形態では、試料は、血液または痰である。
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態では、複数の微生物遺伝物質を単離することは、微生物遺伝物質を陰イオン性－交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン－交換微小粒子を洗浄することを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、単離された微生物遺伝物質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せである。一部の実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖である。
一部の実施形態では、試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することは、１つまたは複数の微生物細胞を、ＤＮＡインターカレーティング色素（ＤＮＡｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇｄｙｅ）を含む溶解緩衝液と接触させることを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡインターカレーティング色素は、エチジウムモノアジド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｍｏｎａｚｉｄｅ）（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、またはその組合せから選択される。
【０００７】
一部の実施形態では、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン－交換微小粒子を洗浄することは、単離された複数の微生物遺伝物質を、約３～７．５のｐＨ、少なくとも１つの一価の塩であって、一価の塩濃度が約０．７５Ｍ～２．７５Ｍである一価の塩、少なくとも１つの非イオン性洗浄剤であって、非イオン性洗浄剤濃度が約０．０１％～１．０％（ｖ／ｖ）である非イオン性洗浄剤、および少なくとも１つの両性イオン性洗浄剤であって、両性イオン性洗浄剤濃度が約０．１×～４００×ＣＭＣである両性イオン性洗浄剤を含む洗浄緩衝液と接触させることを含む。
一部の実施形態では、複数の微生物遺伝物質を増幅することは、約４００～２０００ｂｐのアンプリコンを生ずることを含む。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、１つまたは複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが約４０～２００原子である。
【０００８】
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、１つまたは複数の結合部分を含む。
別の態様では、本テクノロジーは、多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであって、第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ～１０ｍｌの試料を受け取るように構成されており；第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；第３のチャンバーが溶解終結溶液（ｌｙｓｉｓｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ）貯蔵チャンバーであり；第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および流体デバイス（ｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅ）であって、複数の流れチャネル（ｆｌｏｗｃｈａｎｎｅｌ）を含む流体デバイスであって、第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、かつ第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイスを含むデバイスを提供する。
一部の実施形態では、流体デバイスは、流れゲート（ｆｌｏｗ－ｇａｔｅ）であって、２つ以上のチャンバーを連結する流れチャネル間に配置されている流れゲートをさらに含む。
一部の実施形態では、流体デバイスは、１つまたは複数のニューマチックインターフェース（ｐｎｅｕｍａｔｉｃｉｎｔｅｒｆａｃｅ）であって、少なくとも１つのチャンバーに流体連結（ｆｌｕｉｄｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）されているニューマチックインターフェースをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーは、陰イオン交換樹脂を含む。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーは、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂を含む。
一部の実施形態では、溶解用溶液貯蔵チャンバーは、真核生物溶解用溶液を含み、試料と組み合わせられた真核生物溶解用溶液は、約０．２５％～１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および約０．２％～０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含む。
一部の実施形態では、Ｔｗｅｅｎ界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－４０、およびＴｗｅｅｎ－８０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎは、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００またはＴｒｉｔｏｎＸ－１１４である。
【００１０】
一部の実施形態では、ＩＧＥＰＡＬは、ＩＧＥＰＡＬＣＯ－５２０、ＩＧＥＰＡＬＣＯ－６３０、およびＩＧＥＰＡＬＣＯ－７２０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、流体撹拌は、チャンバーの１つまたは複数中への無菌気体（ｓｔｅｒｉｌｅｇａｓ）の流れによって作製される。
一部の実施形態では、デバイスは、独立型デバイスである。一部の実施形態では、デバイスは、第２のデバイス中のモジュールであり、ここで、第２のデバイスは、モジュールの上流および／または下流処理を行う。
別の態様では、本テクノロジーは、１つまたは複数のＤＩＡＮＡを含む組成物であって、ＤＩＡＮＡが、配列番号１～３７からなる群から選択される配列を有する組成物を提供する。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＤＩＡＮＡは、固体支持体に結合している。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＤＩＡＮＡは、検出可能なマーカーを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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