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公開番号2024154431
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-30
出願番号2024075300,2020550607
出願日2024-05-07,2019-03-19
発明の名称ペリオスチン抗体およびその使用方法
出願人バイオヴェンチャーズリミテッドライアビリティカンパニー,エスアールアイインターナショナル,SRI International
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/30 20060101AFI20241023BHJP(有機化学)
要約【課題】がん細胞と、正常細胞とのグリコシル化の差異を特異的に標的とする新しい抗体を提供する。
【解決手段】本発明者らは、ヒトペリオスチンタンパク質上のがん特異的グリカン(炭水化物)改変を認識する抗原結合試薬および抗原結合コンジュゲートを開発した。Mgat3遺伝子が増幅しているがんを特異的に処置するための、これらの組成物を使用する様々なin vitroおよびin vivoでの診断および/または治療方法も本明細書に開示される。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、
ＣＤＲＨ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、
ＣＤＲＨ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、
ＣＤＲＬ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つを含む抗原結合試薬。
続きを表示（約 780 文字）【請求項２】
ヒトペリオスチン糖タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１に記載の抗原結合試薬。
【請求項３】
前記ヒトペリオスチン糖タンパク質のグリカンエピトープに特異的に結合する、請求項２に記載の抗原結合試薬。
【請求項４】
前記グリカンエピトープががん細胞上に特異的に存在する、請求項３に記載の抗原結合試薬。
【請求項５】
前記がん細胞が、卵巣がん、グリア芽腫、腎臓がん、子宮がん、直腸がん、結腸がん、腺癌および肺がんからなる群から選択されるがんに由来するがん細胞を含む、請求項４に記載の抗原結合試薬。
【請求項６】
前記がん細胞のＭｇａｔ３遺伝子の発現が上昇している、請求項４に記載の抗原結合試薬。
【請求項７】
前記グリカンエピトープがＮ－結合グリカン構造を含む、請求項３～６のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
【請求項８】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＣＤＲＨ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、
ＣＤＲＨ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、
ＣＤＲＨ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、
ＣＤＲＬ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）
の全部を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
【請求項９】
配列番号５を含む重鎖可変領域と、配列番号６を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
【請求項１０】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＩｇＧモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合試薬。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，６８１号および２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，９１５号（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
連邦政府に支援された研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（「ＮＩＨ」）の認可番号ＵＯ１ＣＡ１６８８７０－０１によって認められた米国政府の支援と共に為されたものである。米国は、本発明におけるある特定の権利を有する。
続きを表示（約 6,600 文字）【０００２】
配列表
本出願には配列表が添付される。配列は、本明細書においては配列番号によって列挙され、対応する配列は、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書と共に提出される配列表に見出される。
【背景技術】
【０００３】
序論
がんの抗体に基づく療法および診断は、がん患者を処置および診断するための重要な戦略になってきている。正常細胞と比較して、がん細胞によって選択的に発現される細胞表面抗原は、標的がん療法および診断ツールを開発する魅力的な手段を提供する。しかしながら、この分野における重要な課題は、がん細胞を選択的に標的とするために使用することができる抗原を同定することであった。ペプチド抗原は、がん細胞特異的抗体を開発するために一般的に使用されるが、そのような抗原の適用可能性は、ある特定の状況では、例えば、ペプチド抗原の発現が正常細胞とがん細胞において類似している場合、限定的であり得る。
タンパク質におけるがん特異的グリコシル化変化は、がん細胞と、正常細胞とを区別することができ、診断適用と治療適用の両方の開発において有用であり得る別の魅力的な抗原群である。しかしながら、がん細胞上で選択的に発現される炭水化物部分を特異的に標的とする抗体はわずかしか開発されていない。かくして、がん細胞と、正常細胞とのグリコシル化の差異を特異的に標的とする新しい抗体が当業界において依然として必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一態様では、抗原結合試薬が提供される。抗原結合試薬は、ヒトペリオスチン糖タンパク質、好ましくは、ヒトペリオスチン糖タンパク質のグリカンエピトープに特異的に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合試薬は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲＨ１、ＧＦＩＦＤＤＹＡＭＨ（配列番号１）、ＣＤＲＨ２、ＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴ（配列番号２）、ＣＤＲＨ３、ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号３）、ＣＤＲＬ３、ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号４）または配列番号５を含む重鎖可変領域および配列番号６を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
別の態様では、抗原結合コンジュゲートが提供される。抗原結合コンジュゲートは、薬剤に連結された本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか１つを含んでもよい。
さらなる態様では、細胞が提供される。細胞は、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれかまたは抗原結合コンジュゲートのいずれかを含んでもよい。
別の態様では、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または細胞のいずれかと、薬学的担体、賦形剤、または希釈剤とを含んでもよい。
別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞をイメージングするための方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に記載の抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与すること、およびイメージングモダリティを使用して対象の少なくとも一部の画像を生成することを含んでもよい。好ましくは、これらの方法の実施形態では、抗原結合試薬、抗原結合コンジュゲート、または医薬組成物に結合した細胞のイメージングは、細胞ががん細胞であることを示す。
【０００５】
さらなる態様では、本発明は、対象の試料中のがん細胞を検出する方法に関する。この方法は、対象から試料を取得すること、試料と、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれかまたは抗原結合コンジュゲートのいずれかとを接触させること、および試料中の細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合を検出することを含んでもよい。好適には、細胞に対する抗原結合試薬または抗原結合コンジュゲートの結合は、細胞ががん細胞であることを示す。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがん細胞を処置する方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に開示される抗原結合試薬のいずれか、抗原結合コンジュゲートのいずれか、細胞のいずれか、または医薬組成物のいずれかを有効量で投与して、対象におけるがんを処置することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１Ａ～１Ｃは、ペリオスチンドメイン構造および複雑なＮ結合グリコシル化の位置を示す。図１Ａは、最後のＦＡＳ１ドメインに印を付けたグリコシル化部位を有するヒトペリオスチンタンパク質のドメインマップを示す。
図１Ｂは、アスパラギン５９９が位置する非構造ループを示すＦＡＳ４ドメインのＮＭＲ構造（ＰＤＢ５ＷＴ７）を示す
35
。Ｎ５９９溶媒に曝露されたヒトペリオスチンのＦＡＳ１～ＦＡＳ４ドメインの結晶構造（ＰＤＢ５ＹＪＧ）
34
。
図１Ｃは、抗Ｆｌａｇ樹脂上で培養上清から精製されたペリオスチンタンパク質のウェスタンブロット分析である。上の切り取られた画像は、レクチンＥ－ＰＨＡ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を使用して検出され、下の切り取られた画像は、ペリオスチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた同じブロットの検出である。それぞれの細胞株に関する以前に検出されたグリカン構造の例を、各レーンの上に示す
3、39
。
図２は、選択、精製、および検証手法の流れ図を示す。まず、卵巣がん酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーを、非悪性Ｐｒｏ５－ＰＮおよびＬｅｃ４－ＰＮ細胞でそれぞれ６回サブトラクションにかけた。非バインダーを増殖させ、ＯＶＣＡＲ３－ＰＮ細胞に添加して、複数回選択した。バインダーのクローン集団を、酵母細胞ＥＬＩＳＡを使用して評価し、二分岐グリカンに対する結合特異性を有する酵母を、分泌型ｓｃＦｖにした。クローン９を、示されたタグ付きのビオボディ（ｂｉｏｂｏｄｙ）として知られるビオチン標識された抗体に変換し、細胞株および異種移植腫瘍モデルを使用して評価した。
図３は、代表的な酵母細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。候補クローン酵母集団の示差的結合を、２４ウェルプレート上、９０％集密度で播種したＰｒｏ５－ＰＮ（青色）、Ｌｅｃ４－ＰＮ（赤色）、およびＯＶＣＡＲ３－ＰＮ（緑色）細胞上で測定した。結合した酵母（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒで標識された）を、洗浄の前後に測定した。示された代表的なデータは、示されたクローンに関する、それぞれの細胞株についてのそれぞれの洗浄後に結合した酵母のパーセンテージを反映する。
図４Ａ～図４Ｅは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディに関する特異性、細胞局在化および抗体依存性細胞傷害性を示す。図４Ａは、ストレプトアビジンＡＰＣ（赤色の線）またはストレプトアビジンＡＰＣのみ（青色の線）と予め混合したｓｃＦｖＣ９ビオボディで染色されたＯＶＣＡＲ３－ＰＮ対照ｓｈＲＮＡおよびＯＶＣＡＲ３－ＰＮＧｎＴ－ＩＩＩｓｈＲＮＡ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
図４Ｂは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディ結合およびＯＶＣＡ２６細胞への内在化の代表的な画像を示す。バーは１０μｍである。
図４Ｃは、細胞力価グロー発光生存アッセイを使用する細胞の細胞傷害性の機能分析を示す。ｓｃＦｖＣ９ビオボディを、抗ｍｙｃｍＡｂと予め混合し、３７℃で４８時間にわたって連続希釈液を細胞に添加した。示される結果は、３回の独立実験の代表である。
図４Ｄおよび図４Ｅは、ヒトグリア芽腫細胞中でのｓｃＦｖＣ９細胞の結合および特異性を示す。図４Ｄは、Ｃ２として知られる単一細胞単離ＬＮ１８クローン中でのＭｇａｔ３遺伝子のＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ＫＯが、二分岐Ｎ－グリカンの喪失を示すＥ－ＰＨＡ結合の非存在によって確認されることを示す。対照Ａ１として知られる非標的単一細胞単離クローンは、Ｅ－ＰＨＡレクチンの結合によって確認されるＭｇａｔ３発現を有する。バーは２０μｍである。
図４Ｅは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディが、ＬＮ１８対照Ａ１クローンに結合し、ＬＮ１８Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９Ｍｇａｔ３ＫＯクローンＣ２に結合しないことを示す。
図５は、卵巣腫瘍のＩＶＩＳイメージングを示す。上パネル：Ａ１８４７ヒト卵巣がん細胞に由来する６ｗｋの皮下異種移植腫瘍を有する免疫不全のＮＳＧ雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体または陰性対照（ＩＲＢ６８０Ｗのみ）の眼窩後方注射の前後にイメージングした。中央パネル：８ｗｋの卵巣内Ｌｕｃ－ＩＤ８マウス卵巣がん細胞を有する免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体または陰性対照（ＩＲＢ６８０Ｗのみ）の注射の前後にイメージングした。下パネル：８ｗｋの腹腔内Ｌｕｃ－ＩＤ８マウス卵巣がん細胞を有する免疫能力があるＣ５７Ｂｌ／６雌マウスを、ｓｃＦｖＣ９／ＩＲＢ６８０Ｗ複合体またはＩＲＢ６８０Ｗのみの注射の前後にイメージングした。
図６は、２４時間の時点での腫瘍および組織におけるｓｃＦｖＣ９ビオボディの検出を示す。皮下Ａ１８４７異種移植腫瘍を有する免疫不全の雌ＮＳＧマウスに、剖検および組織採取の２４時間前にｓｃＦｖＣ９ビオボディをＩＶにより注射した。ＤＡＰＩを用いる対抗染色の前に、切片をストレプトアビジンＱｄｏｔ（１ＸＰＢＳ中で１：５０）で染色した。白色の矢印は、本文中で考察される目的の領域に印を付けるものである。バーは１００μｍである。
図７Ａおよび図７Ｂは、ｓｃＦｖＣ９ビオボディを用いたＭＲ試験を示す。図７Ａは、細胞のみ、抗ｆｌａｇ磁気ビーズのみ、またはｓｃＦｖＣ９ビオボディおよび抗ｆｌａｇ磁気ビーズを含む細胞を重ねたファントムチューブをＭＲイメージングしたものを示す。示される代表画像およびグラフ中の結果は、右に向かって、３回の独立実験に由来する平均減少シグナル強度を表す。±ＳＥＭＰ＜０．０００１。
図７Ｂは、Ａ１８４７皮下腫瘍を有する免疫不全のＮＳＧ雌マウスに、１：２で磁気アビジンビーズと結合したｓｃＦｖＣ９を注射したことを示す。代表的な１時間の画像を示し、各時点での累積正規化（所与のＲＯＩに関するＳＩ腫瘍／ＳＩ筋肉）シグナル強度を、右に向かってグラフ化する。
図８は、腹腔内注射の８週後のマウスメソテリン
Int
Ｌｕｃ－ＩＤ８マウス卵巣がんモデルおよびルシフェリンを用いたｉｎｖｉｖｏでのイメージングを示す。
図９は、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウス（ＩＰ注射後８週）におけるマウスメソテリン
Int
Ｌｕｃ－ＩＤ８卵巣がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ－グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡのみ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス。
図１０は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン
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ＥＫＶＸ肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ－グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。
図１１は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン
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Ｈ４６０肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ－グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。
図１２は、ＮＳＧ雌マウス（ＩＶ注射後４週）におけるヒトメソテリン
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Ａ５４９肺がんおよび標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）に結合したビオチン化抗メソテリンナノボディ（ＭＮ）または抗Ｎ－グリコシル化ペリオスチン（Ｃ９）を用いたｉｎｖｉｖｏでのイメージングを示す。陰性対照（ＳＡのみ）：標識されたストレプトアビジンのみを注射した腫瘍担持ＮＳＧマウス。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ここで、本発明者らは、ヒトペリオスチンタンパク質上のがん特異的グリカン（炭水化物）改変を認識する抗原結合試薬を開発した。以前の研究において、本発明者らは、卵巣がん細胞などのがん細胞中で特異的に発現されるヒトペリオスチンタンパク質上の通常ではない二分岐Ｎ結合グリカン構造を発見した。Abbott et al., Proteomics 10(3): 470-481 (2010)を参照されたい。Ｎ結合グリカン構造は、ガラクトースキャッピングおよびシアル酸伸長の欠如のため通常のものではなく、例えば、Allam, Heba et al. “Glycomic Analysis of Membrane Glycoproteins with Bisecting Glycosylation from Ovarian Cancer Tissues Reveals Novel Structures and Functions.” Journal of Proteome Research 14.1 (2015): 434-446. PMCに記載されている。
【０００９】
腫瘍細胞は、典型的には、診断のためのバイオマーカーならびに免疫療法のための候補として役立ち得る、表面糖タンパク質および糖脂質上でのグリコシル化の腫瘍特異的変化を示す
1-4
。グリコシル化のそのような変化は、その表面発現および腫瘍細胞からの潜在的な分泌をもたらす、ユニークなグリコシルトランスフェラーゼおよび糖タンパク質の発現レベルの変更に起因する。しかしながら、この研究領域は、グリコシル化の腫瘍細胞特異的変化を標的とするのに有用なほんのわずかな特異的抗炭水化物抗体を有することによって妨げられている。
【００１０】
そのような特異的抗炭水化物抗体を開発するための１つの手法は、酵母ディスプレイである。これらの技術は、認識試薬の親和性および特異性を改善することができる
5-7
。この方法では、組換え抗体が、細胞壁構成要素（Ａｇａ－２）との融合タンパク質として酵母表面上に提示され、ライブラリー生成は、酵母において固有の相同組換えシステムによって容易になる
8、9
。フローサイトメトリーと、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として発現される組換え抗体の細胞表面ディスプレイとのカップリングは、酵母表面でのｓｃＦｖ発現と、抗原へのｓｃＦｖ結合との両方のモニタリングを可能にする
10
。酵母ディスプレイはまた、様々な指向性進化適用についても非常に有効であることが証明されている
11-15
。これらの方法は、メソテリン
16
、ＴＥＭ１
17
、マンノース受容体
18
、グリピカン
19
、およびＢ７－Ｈ４
20
に対するｓｃＦｖを含む、いくつかの医学的に関連するタンパク質を指向する多くの機能的ｓｃＦｖの同定を可能にしてきた、ｓｃＦｖの時間および費用効果的な生産およびスクリーニングにつながる。
（【００１１】以降は省略されています）

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