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公開番号2024145788
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-15
出願番号2023058286
出願日2023-03-31
発明の名称アセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法
出願人国立大学法人広島大学,国立研究開発法人産業技術総合研究所
代理人個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20241004BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】微生物発酵によって、糖からアセトインを高効率で得られるようにする。
【解決手段】アセトインを生成する組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐CoAからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、
遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含むことを特徴とするアセトインを生成する組換え細菌。
続きを表示（約 760 文字）【請求項２】
前記細菌は、好熱性細菌である請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項３】
前記好熱性細菌は、好熱性酢酸生成菌である請求項２に記載の組換え細菌。
【請求項４】
前記好熱性酢酸生成菌は、モーレラ（Moorella）属細菌であることを特徴とする請求項３に記載の組換え細菌。
【請求項５】
前記細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する内在性酵素を有し、
前記遺伝子工学的手法により導入された、前記アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子は、前記内在性酵素と同一の酵素を発現することを特徴とする請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項６】
前記アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子は、Bacillus subtilis IPE5-4由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ発現遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項７】
受領番号ＮＩＴＥＡＰ－０３８６５として寄託された請求項１に記載の組換え細菌。
【請求項８】
糖の存在下で請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え細菌を培養してアセトインを生成させるステップを備えていることを特徴とするアセトインの製造方法。
【請求項９】
生成されたアセトインを回収するステップをさらに備えていることを特徴とする請求項８に記載のアセトインの製造方法。
【請求項１０】
前記細菌として好熱性細菌を用い、前記アセトインを生成させるステップにおいて、前記組換え細菌を５５℃～６５℃で培養することを特徴とする請求項８に記載のアセトインの製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトインを生成する組換え細菌及びそれを用いたアセトインの製造方法に関する。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
これまで人類は石炭や石油等の化石燃料の消費によって産業を発達させてきた。しかし、これら化石燃料は限りある資源であるため枯渇が懸念されており、代替エネルギーや代替材料、代替製法の開発は急務である。
【０００３】
例えば、アセトイン（ＩＵＰＡＣ名：３－ヒドロキシ－２－ブタノン）は香料として用いられ、またゴム原料となるブタジエンの合成前駆物質、及び炭化水素ジェット燃料の製造に用いられるメチルエチルケトンの合成前駆物質として用いられている。アセトインは果物や野菜に含まれており、このような天然資源から抽出することが可能である。しかし、アセトイン供給の大部分は化石燃料からの化学合成に依存しており、上述のような将来的な化石燃料の枯渇により、アセトインを十分に供給できなくなることが懸念されている。このため、近年においては、微生物発酵法によってアセトインを生成する種々の技術の開発が進められており、アセトインの新たな代替製法として注目を集めている。なお、アセトインは米国エネルギー省が定めたバイオベースの基幹化合物三十のうちの一つに指定されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には遺伝子組換え微生物を利用して、メタノールからアセトインを生成する技術が提示されている。また、非特許文献２には天然由来好熱細菌Geobacillus XT15株を利用して、トウモロコシの湿式粉砕から得られる粉末状の副産物を含有する窒素源からアセトインを生成する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Drejer EB, Chan D, Haupka C, Wendisch VF, Brautaset T, Irla M. Methanol-based acetoin production by genetically engineered Bacillus methanolicus. Green Chem. 2020;22:788-802.
Xiao, Z., Wang, X., Huang, Y. et al. Thermophilic fermentation of acetoin and 2,3-butanediol by a novel Geobacillus strain. Biotechnol Biofuels 5, 88 (2012). https://doi.org/10.1186/1754-6834-5-88
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の非特許文献１に開示された組換え微生物によってアセトインを生成するためには基質としてメタノールを用いる必要があるが、メタノールの供給についても化石燃料からの合成に依存している。このため、天然資源を基質として用いるアセトインの代替製法を開発することが望ましい。一方、従来の非特許文献２に開示された天然由来好熱細菌を用いる方法では、天然資源を基質としてアセトインを製造する技術が提示されている。しかし、非特許文献２に開示された微生物では、アセトイン以外にも多種の副生物が生成し、アセトインの生成効率が高いとは言えない。このため、未だ更にアセトインの生成効率が高い方法と共に、その方法を可能とするための微生物が求められている。
【０００７】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物発酵によって、糖からアセトインを高効率で得られるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌に対して、遺伝子工学的手法により、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを導入することで、アセトインを高効率で生成可能な組換え細菌を提供できることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
具体的に、本発明に係るアセトインを生成する組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有する細菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により導入された、アセト乳酸からアセトインを生成する脱炭酸反応を触媒する外来の酵素発現遺伝子と、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素発現遺伝子とを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る組換え細菌は、糖から中間体としてのピルビン酸を経てアセト乳酸を生成する代謝経路を有しており、さらに、当該代謝において生成されるアセト乳酸からアセトインを生成する外来の酵素を発現する。このため、当該組換え細菌を糖の存在下で培養することによってアセトインを生成でき、すなわち天然資源を基質としてアセトインを生成可能な組換え細菌を提供することができる。また、本発明に係る組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡからピルビン酸を生成する酵素発現遺伝子をさらに導入している。このような当該組換え細菌は、糖の存在下で培養することによってアセトインを高効率で生成することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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