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公開番号2024133736
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-02
出願番号2024114035,2023179453
出願日2024-07-17,2016-04-06
発明の名称非ヒト動物におけるヒト化T細胞媒介性免疫応答
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド,REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
代理人個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20240925BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】遺伝子操作された非ヒト動物(例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット)を提供すること。
【解決手段】遺伝子操作された非ヒト動物は、ヒト化T細胞共受容体(例えば、ヒト化CD4及び/若しくはCD8(例えば、CD8α及び/若しくはCD8β))、少なくとも1つのヒトTCR可変領域遺伝子セグメントによりコードされる可変ドメインを含むヒト若しくはヒト化T細胞受容体(TCR)、及び/又はヒト化T細胞共受容体に結合するヒト若しくはヒト化主要組織適合複合体(例えば、それぞれ、ヒト若しくはヒト化MHC II(例えば、MHC IIα及び/又はMHC IIβ鎖)及び/又はMHC I(例えば、MHC Iα)、場合により、ヒト又はヒト化β2ミクログロブリン)を発現し得る。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
遺伝子改変マウス細胞であって、そのゲノム中に、
（ａ）ヒトＣＤ４ポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＣＤ４ポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むキメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
（ｂ）キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドをコードする第２の核酸配列およびキメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドをコードする第３の核酸配列であって、
前記キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドは、ヒトＣＤ８αポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＣＤ８αポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドは、ヒトＣＤ８βポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＣＤ８βポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第２の核酸配列および第３の核酸配列
（ｃ）それぞれ、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドおよびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドをコードする第４の核酸配列および第５の核酸配列であって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩαポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＭＨＣＩＩαポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＭＨＣＩＩβポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第４の核酸配列および第５の核酸配列
（ｄ）キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第６の核酸配列であって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩポリペプチドの細胞外部分ならびにマウスＭＨＣＩポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第６の核酸配列、ならびに
（ｅ）Ｔ細胞において再配列してマウスＴＣＲα定常領域配列に操作可能に連結している再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成することができる少なくとも１つのヒトＶα遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪα遺伝子セグメントを含む非再配列Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変領域配列、および
Ｔ細胞において再配列してマウスＴＣＲβ定常領域配列に操作可能に連結している再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができる少なくとも１つのヒトＶβ遺伝子セグメント、少なくとも１つのヒトＤβ遺伝子セグメント、および少なくとも１つのヒトＪβ遺伝子セグメントを含む非再配列ＴＣＲβ可変領域配列
を含み、
マウスＴＣＲα定常領域配列に操作可能に連結している前記再配列ヒトＶα／Ｊα配列は、マウスＴＣＲα定常ドメインに操作可能に連結しているヒトＴＣＲα可変ドメインを含むヒト化ＴＣＲα鎖をコードし、
マウスＴＣＲβ定常領域配列に操作可能に連結している前記再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列は、マウスＴＣＲβ定常ドメインに操作可能に連結しているヒトＴＣＲβ可変ドメインを含むヒト化ＴＣＲβ鎖をコードする、
遺伝子改変マウス細胞。
続きを表示（約 2,500 文字）【請求項２】
（ａ）前記第１の核酸配列が内在性ＣＤ４座に存在する、
（ｂ）前記第２の核酸配列が内在性ＣＤ８α座に存在し、前記第３の核酸配列が内在性ＣＤ８β座に存在する、
（ｃ）前記第４の核酸配列が内在性ＭＨＣＩＩα座に存在し、前記第５の核酸配列が内在性ＭＨＣＩＩβ座に存在する、
（ｄ）前記第６の核酸配列が内在性ＭＨＣＩ座に存在する、および／または
（ｅ）前記非再配列ＴＣＲα可変領域配列が内在性ＴＣＲα可変領域座に存在し、前記非再配列ＴＣＲβ可変領域配列が内在性ＴＣＲβ可変領域座に存在する、
請求項１に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項３】
（ａ）前記第１の核酸配列が、前記内在性ＣＤ４座に存在し、マウスＣＤ４プロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されている、
（ｂ）前記第２の核酸配列が、前記内在性ＣＤ８α座に存在し、マウスＣＤ８αプロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されており、前記第３の核酸配列が、前記内在性ＣＤ８β座に存在し、マウスＣＤ８βプロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されている、
（ｃ）前記第４の核酸配列が、前記内在性ＭＨＣＩＩα座に存在し、マウスＭＨＣＩＩαプロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されており、前記第５の核酸配列が、前記内在性ＭＨＣＩＩβ座に存在し、マウスＭＨＣＩＩβプロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されている、
（ｄ）前記第６の核酸配列が、前記内在性ＭＨＣＩ座に存在し、マウスＭＨＣＩプロモーターおよび調節エレメントに操作可能に連結されている、あるいは
（ｅ）（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせである、
請求項２に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項４】
（ａ）前記キメラヒト／マウスＣＤ４ポリペプチドが、前記マウスＣＤ４ポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ヒトＣＤ４ポリペプチドのＤ１、Ｄ２およびＤ３ドメインを含む、
（ｂ）前記キメラヒト／マウスＣＤ８αポリペプチドが、前記マウスＣＤ８αポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ヒトＣＤ８αポリペプチドのＩｇＶ様ドメインを含み、前記キメラヒト／マウスＣＤ８βポリペプチドが、前記マウスＣＤ８βポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ヒトＣＤ８βポリペプチドのＩｇＶ様ドメインを含む、
（ｃ）前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドが、前記マウスＭＨＣＩＩαポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドのα１およびα２ドメインを含み、前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドが、前記マウスＭＨＣＩＩβポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドのβ１およびβ２ドメインを含む、および／または
（ｄ）前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドが、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドの前記膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結している前記ＨＬＡクラスＩポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含む、
請求項１に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項５】
（ａ）前記ＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドが、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰの任意のα鎖からなる群から選択される、
（ｂ）前記ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドが、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰの任意のβ鎖からなる群から選択される、および／または
（ｃ）前記ＨＬＡクラスＩポリペプチドが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される、
請求項１に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項６】
前記ＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドがＨＬＡ－ＤＲの前記α鎖であり、前記ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドがＨＬＡ－ＤＲの前記β鎖であり、
前記ＨＬＡクラスＩポリペプチドがＨＬＡ－Ａである、請求項５に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項７】
前記ＨＬＡクラスＩＩαポリペプチドがＨＬＡ－ＤＲ２の前記α鎖であり、前記ＨＬＡクラスＩＩβポリペプチドがＨＬＡ－ＤＲ２の前記β鎖である、請求項６に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項８】
前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質のα１、α２、およびα３ドメインを含む、請求項６に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項９】
前記非再配列ＴＣＲα可変領域配列が、ヒトＶα遺伝子セグメントの完全なレパートリおよびヒトＪα遺伝子セグメントの完全なレパートリを含む、および／または前記非再配列ＴＣＲβ可変領域配列が、ヒトＶβ遺伝子セグメントの完全なレパートリ、ヒトＤβ遺伝子セグメントの完全なレパートリおよびヒトＪβ遺伝子セグメントの完全なレパートリを含む、請求項１に記載の遺伝子改変マウス細胞。
【請求項１０】
内在性ＴＣＲα可変領域座が、機能的な内在性Ｖα遺伝子セグメントを欠く、および／または機能的な内在性Ｊα遺伝子セグメントを欠く、および／または
内在性ＴＣＲβ可変領域座が、（ａ）機能的な内在性Ｖβ遺伝子セグメントを欠く、（ｂ）機能的な内在性Ｄβ遺伝子セグメントを欠く、（ｃ）機能的な内在性Ｊβ遺伝子セグメントを欠く、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）
の
任意の組み合わせである、
請求項１に記載の遺伝子改変マウス細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願シリアル番号第６２／１４３，６８７号（２０１５年４月６日出願）及び同第６２／１５８，８０４号（２０１５年５月８日出願）及び同第６２／１８６，９３５号（２０１５年６月３０日出願）の優先権を主張し、これらのそれぞれの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,600 文字）【０００２】
配列表
配列表の正式なコピーは、２０１６年４月６日に作成され、かつ５６．７キロバイトのサイズを有する、ファイル名「２０１６－０４－０６－１０１４５ＷＯ０１－ＳＥＱ－ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、実質的にヒト（化）Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始することができ、（ｉ）１つ又は２つ以上のヒト（化）Ｔ細胞共受容体（例えば、ＣＤ４及び／又はＣＤ８（例えば、ＣＤ８α及び／又はＣＤ８β））、（ｉｉ）１つ又は２つ以上のヒト（化）Ｔ細胞共受容体と会合する１つ又は２つ以上のヒト（化）主要組織適合複合体（例えば、ＭＨＣＩＩ（例えば、ＭＨＣＩＩα及び／又はＭＨＣＩＩβ）及び／又はＭＨＣＩ（例えば、ＭＨＣＩα及び／又はβ２ミクログロブリン）、並びに／又は（ｉｉｉ）ヒト（化）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）を発現することができる、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）；胚、組織、細胞、及び／又は非ヒト動物から単離された核酸；非ヒト動物を生産する方法；並びにヒトの治療の開発のために、非ヒト動物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
適応免疫応答において、外来抗原は、Ｂリンパ球上の受容体分子（例えば、免疫グロブリン）及びＴリンパ球状の受容体分子（例えば、Ｔ細胞受容体、ＴＣＲとも呼ばれる）により認識される。これらの外来抗原は、細胞の表面上に、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれ、特に、ヒトにおいてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる特殊なタンパク質により、ペプチドフラグメントとして提示される。Ｔ細胞媒介性応答中に、ＭＨＣ分子により提示された抗原は、Ｔ細胞受容体により認識される。しかしながら、ＭＨＣ－抗原複合体のより多くのＴ細胞受容体認識が、効果的な免疫応答に必要とされる。Ｔ細胞共受容体分子（例えば、ＣＤ４又はＣＤ８）のＭＨＣのインバリアントな部分への結合も必要とされる。
【０００５】
Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞を含む複数の多様性を有する。ヘルパーＴ細胞は、共受容体ＣＤ４を発現し、ＭＨＣＩＩ分子に結合した抗原を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系における他のエフェクター細胞、例えば、抗体を生成するＭＨＣＩＩ発現Ｂ細胞、病原体を破壊するＭＨＣＩＩ発現マクロファージ等を活性化する。ＣＤ４及びＴ細胞受容体の同じＭＨＣＩＩにより提示された外来抗原への結合により、Ｔ細胞がその抗原に対してより顕著に高感度になる。
【０００６】
対照的に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、共受容体ＣＤ８を発現し、ＭＨＣＩ分子に結合した外来抗原を認識する。ＣＴＬは、それ自体の膜結合ＴＣＲにより認識されたＭＨＣＩ結合ペプチドを有する任意の細胞を殺傷するように特殊化されている。細胞が、（例えば、ウイルス、腫瘍、又は他の非自己起源の）通常存在しない細胞タンパク質由来ペプチドを提示する場合、このようなペプチドは、ＣＴＬにより認識される。同ＣＴＬは活性化され、このペプチドを提示している細胞を殺傷する。ＣＤ４と同様に、ＣＤ８の結合により、ＣＴＬがＭＨＣＩにより提示された抗原に対してより高感度になる。
【０００７】
寛容メカニズムのために、全ての抗原が、Ｔ細胞活性化を引き起こすわけではない。一方で、一部の疾患（例えば、ガン、自己免疫疾患）では、自己タンパク質由来のペプチドが、免疫系の細胞コンポーネントのターゲットになる。同ターゲット化により、このようなペプチドを提示している細胞の破壊がもたらされる。臨床的に意義のある抗原（例えば、種々の種類のガンに関連する抗原）及び／又は、臨床的に意義のある抗原に結合するＴＣＲ配列を認識することにおける顕著な進歩がなされてきた。しかしながら、ヒトＴ細胞における適切な応答を引き起こすであろう臨床的に意義のあるペプチド、及び／又は臨床的に意義のある抗原に結合することができるＴＣＲ（例えば、ガンの適応免疫療法用、自己免疫用のＴ細胞ワクチン等）の特定及び選択を改善するために、ヒトの免疫系の態様を模倣するｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏ系についての必要性が未だに存在する。このため、ヒトの免疫系のコンポーネント、特に、Ｔ細胞免疫応答のコンポーネントを提示することができる生体系（例えば、遺伝子改変非ヒト動物及び細胞）についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で開示されるように、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系を含む遺伝子改変非ヒト動物の胸腺は、コントロール動物と同様の絶対数の胸腺細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞を有する。加えて、これらの細胞は、コントロール動物に対して、シングルポジティブなＴ細胞への同等の発達を示し、抗原、例えば、ウイルス抗原に対する堅牢なヒト細胞応答を生じさせることができる。非ヒト動物のヒト細胞応答は、一般的には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）細胞外ドメインにより形成されたペプチド結合クレフトにおいて提示された抗原を認識するヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）可変ドメインを発現している、活性化非ヒトＴ細胞を含む。同細胞外ドメインは、非ヒト抗原提示細胞の表面上に発現される場合がある。一部の実施態様では、実質的にヒト化されたＴ細胞免疫系は、
（Ａ）非ヒトＴ細胞であって、
（ｉ）ヒトＴ細胞共受容体の細胞外部分の一部又は全部を含むＴ細胞共受容体ポリペプチド、例えば、１つ又は２つ以上のヒトＴ細胞共受容体細胞外ドメインを含むＴ細胞共受容体ポリペプチドを、Ｔ細胞共受容体ポリペプチドが、
（ａ）ヒト又はヒト化ＨＬＡ分子の１つ又は２つ以上の細胞外ドメイン（例えば、Ｔ細胞共受容体ポリペプチドについての結合部位である第１のヒトＨＬＡ細胞外ドメイン、及び／又はペプチド結合クレフトを形成する第２のヒトＨＬＡ細胞外ドメインと、例えば、第３のヒトＨＬＡ細胞外ドメイン）
（ｂ）ヒト又はヒト化ＴＣＲ可変ドメイン（例えば、少なくとも１つのヒトＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントにより、それぞれコードされるヒト若しくはヒト化ＴＣＲα可変ドメイン並びに／又はヒト又はヒト化ＴＣＲβ可変ドメイン）の細胞外ドメイン、及び／又は
（ｃ）ヒトＴＣＲ定常ドメインの細胞外ドメインと会合可能であり、かつ／又はこれらと会合するように発現し、
（ｉｉ）少なくともヒトＴＣＲ可変ドメインを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、非ヒトＴ細胞と、任意選択で、
（Ｂ）ヒトＨＬＡに関する抗原を提示する非ヒト抗原提示細胞、例えば、その細胞表面上に、２つのＨＬＡ細胞外ドメインにより形成されるペプチド結合クレフトを含み、非ヒトＴ細胞を活性化することができ、及び／又は、同細胞を活性化する、少なくとも１つのＭＨＣ分子を発現する非ヒト抗原提示細胞とを含む。
【０００９】
一態様において、非ヒトＴ細胞及び非ヒト抗原提示細胞は、同じ非ヒト動物に見出される、又は、同動物から単離される。
【００１０】
したがって、本明細書において、
（Ａ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体（例えば、ヒト若しくはヒト化ＣＤ４及び／又はヒト若しくはヒト化ＣＤ８（例えば、ヒト若しくはヒト化ＣＤ８α及び／又はヒト若しくはヒト化ＣＤ８β））、
（Ｂ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞共受容体と会合するヒト又はヒト化主要組織適合複合体（例えば、ヒト又はヒト化ＣＤ４に結合するヒト又はヒト化ＭＨＣＩＩ（例えば、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣＩＩα及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣＩＩβ）、並びに／又はヒト又はヒト化ＣＤ８に結合するヒト若しくはヒト化ＭＨＣＩ（例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣＩα、及び場合により、ヒト又はヒト化β２ミクログロブリン）、並びに／又は
（Ｃ）ヒト又はヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）；
並びに、これらを発現している胚、組織、及び細胞、並びにこれらをコードする核酸が提供される。また、開示される非ヒト動物を生産する方法及び同動物を使用する方法も提供される。
（【００１１】以降は省略されています）

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