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公開番号2024111290
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-08-16
出願番号2024101292,2023009555
出願日2024-06-24,2018-07-13
発明の名称ランドマーク転写因子を使用した幹細胞分化による神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、およびオリゴデンドロサイトの誘導
出願人アリールバイオテクノロジーアンドファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/0797 20100101AFI20240808BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ランドマーク転写因子を使用した幹細胞分化による神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、およびオリゴデンドロサイトの誘導の提供。
【解決手段】ヒトiPSC由来の神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトを前例のない効率および機能性で誘導する新規の方法。本発明の核心は、多能性から、外胚葉、神経外胚葉、これらからNPC、これからOPC、これからオリゴデンドロサイトへの経路に沿った重要な複数の分化決定点における、これまでに未知の様式の、実験により発見された転写因子の使用である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
図面に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月１３日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，２４６号の優先権を主張する。
続きを表示（約 5,400 文字）【０００２】
本開示は、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトへの、動態学的に制御された細胞成長プロセスによる多能性幹細胞の分化カスケードを、細胞密度の特定の組合せおよび範囲、試薬濃度、ならびにｍＲＮＡの特定の組合せを利用して、誘導および／または方向づけることに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト幹細胞の生成および後の分化への最近の取組みは、細胞運命の柔軟性、ヒト疾患のためのモデル、および臨床治療に関するパラダイムを変えた。胚性幹細胞（ＥＳＣ）および体細胞から作製する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）はともに、益々増加するリストに挙がる、その対応する初代細胞と識別不能な特定細胞型に分化し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞成長動態および関連するパラメータをモジュレートし、これにより細胞密度の特定の組合せ、試薬濃度、およびｍＲＮＡの組合せを使用して、分化／誘導の方向性を制御することにより、幹細胞を誘導および分化させるための方法を提供する。一態様では、本開示の１つの実利は、機能的で成熟したオリゴデンドロサイトとなり得る神経前駆細胞（ＮＰＣ）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を提供し、ならびに種々の型の髄鞘関連疾患および傷害に関与する治療にオリゴデンドロサイトを直接提供する、新たに開発したプロトコールである。
【０００５】
本開示は、高度に効率的かつ適切に管理された、組織特異的分化におけるマスター制御遺伝子または重要な転写因子の発現を利用する分化方法を提供する。より詳細には、このような因子は、本開示により実証する、適切に改変かつ精製したｍＲＮＡ分子の形態で多能性幹細胞に導入する。
【０００６】
一態様では、本開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子、およびトランス活性化ドメインを有する従来の転写因子（ＴＦ）間の融合物を利用するステップと、このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入するステップと、最適条件下で細胞を維持して特定の分化効率を高め、これにより幹細胞または前駆細胞の多能性状態または前駆状態を特定の系列または組織細胞型に誘導するステップとを含む、細胞分化を誘導する方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子、およびトランス活性化ドメインを有する従来の転写因子（ＴＦ）間の融合物を含む、重要な細胞運命遺伝子を発現する幹細胞（まとめて幹細胞と呼ぶ）を生成するステップと、このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入するステップと、最適条件下で細胞を維持して特定の分化効率を高めるステップとのうちの少なくとも１つを含む、幹細胞または前駆細胞の多能性状態または前駆状態を特定の系列または組織の細胞型に変化させるための方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化を誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた非組織処理培養プレートに蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）多数のＮＰＣを必要とする場合、細胞をコーティングされていない超低接着条件に移して懸濁液中に成長させることにより、ｃ）のＮＰＣを増やし得るステップと
を含む、方法を本明細書において開示する。本態様の実施形態では、ステップｂ）の細胞運命因子は、Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される。一部の実施形態では、トランスフェクションするＲＮＡの量は、６ウェルプレートの１ウェルあたり約１０ｎｇ～約２００ｎｇもしくは約２０ｎｇ～約２００ｎｇであるか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて比例的に調整する。一部の実施形態では、トランスフェクションは、少なくともさらに１回反復する。トランスフェクションは、約２４時間間隔で反復し得る。別の実施形態では、細胞運命因子は、トランス活性化ドメイン、例えば、それらに限定されないがＭｙｏＤまたはＶＰ１６と融合させ得る。一部の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、細胞がステップｃ）の細胞運命因子のうちの１つまたは複数を発現するまで培養する。細胞因子が発現するかどうかの決定は、イムノアッセイおよび／またはｑｔ－ＰＣＲを使用して行うことができるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、ＳＢ４３５４２、ＬＤＮ１９３１８９およびＰＤ１７３０７４のうちの１つまたは複数を、必要に応じて、ステップｃ）の細胞に加え得る。一部の実施形態では、ステップａ）～ｃ）の培養条件は、約２％～約６％の酸素濃度におけるものである。本開示の実施形態では、ステップａ）～ｃ）において使用する培地は、最小必須培地アルファ（ＭＥＭａ）、ダルベッコ改変イーグル培地：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭから選択される。培地はまた、他の成分、例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、およびｂＦＧＦ、Ｎ２もしくはＢ２７、ＢＳＡまたはＨＳＡのうちの１つまたは複数を含み得る。別の実施形態では、培養容器は、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ－ラミニンでコーティングされている。本方法の実施形態では、ステップａ）のｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣは、６ウェルプレートにおいて約０．７５×１０
５
細胞～約１．５×１０
６
細胞／ウェルで播種する。他のサイズの培養容器を使用することもできる。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞～約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。一部の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、約３～約１０日間培養し、この時に細胞がアストロサイト様またはニューロン様形態を有する。約３～約１０日後、約１００％に近いが約７５％よりも多くの細胞が、ＮＰＣ細胞特有の形態を有する。一部の実施形態では、約４０～６０％の細胞が、ＮＰＣ細胞特有の形態を有する。約４０％よりも少ない細胞がＮＰＣ細胞特有の形態を有する場合、細胞選別を使用して細胞を単離することができる。懸濁培養システムを使用してさらに培養すると、さらなる選択が可能となる。一部の実施形態では、ＮＰＣの確認は、細胞運命因子のうちの１つ、例えば、Ｐａｘ６の発現により示すことができる。
【０００９】
本開示の別の態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）をＮＰＣから生成するための方法であって、前記方法は、
ａ）培地を含むコーティングされた培養容器（coatedculture vessel）にＮＰＣを蒔く
ステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の細胞にトランスフェクションして、神経前駆細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるステップと、
ｃ）ステップｃ）の細胞を、ＮＰＣの形態がＯＰＣの形態に変化するまで培養するステップと、
ｄ）多数のＯＰＣを必要とする場合、ｃ）のＯＰＣをコーティングされていない超低接着条件に移して懸濁液中に成長させることにより、増大させ得るステップと
を含む。本方法の実施形態では、ステップａ）において、６ウェルプレートのウェルには、約０．７５×１０
５
細胞／ウェル～約１．５×１０
６
細胞／ウェルで播種する。他のサイズの培養容器を使用することもできる。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞～約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。別の実施形態では、ステップｂ）のトランスフェクションに使用するｍＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数から個別にまたは組み合わせて選択される細胞運命因子をコードする。別の実施形態では、ステップｂ）におけるトランスフェクションのための用量は、６ウェル培養プレートを使用する場合、１細胞運命因子あたり約２０ｎｇ～約１００ｎｇであるか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて、比例的に調整する。別の実施形態では、最初のトランスフェクション後、トランスフェクションは、６ウェル培養プレートを使用する場合、約１０ｎｇ／細胞運命因子～約２００ｎｇ／細胞運命因子のｍＲＮＡの用量で少なくともさらに２回反復するか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて、比例的に調整する。別の実施形態では、培養容器プレートは、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ－ラミニンでコーティングされている。別の実施形態では、ステップａ）～ｃ）に使用する培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａから選択される。一部の実施形態では、培地には、ＫＳＲ、アスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよび／またはビオチンのうちの１つまたは複数を補充する。本方法の実施形態では、ステップａ）～ｄ）の培養条件は、約２％～約６％の酸素濃度におけるものである。別の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、ＯＰＣの形態特性を有する細胞が観察されるまで約４～約２０日間培養する。別の実施形態では、ＯＰＣ生成は、双極性形態および／または細胞運命因子のうちの１つの発現に基づいて確認することができる。約４～約２０日後、約１００％に近いが約７５％よりも多くの細胞が、ＯＰＣ細胞特有の形態を有する。一部の実施形態では、約４０～６０％の細胞が、ＯＰＣ細胞特有の形態を有する。約４０％よりも少ない細胞がＯＰＣ細胞特有の形態を有する場合、細胞選別を使用して細胞を単離することができる。懸濁培養システムを使用してさらに培養すると、さらなる選択が可能となる。一部の実施形態では、ＯＰＣの確認は、細胞運命因子のうちの１つ、例えば、Ｏｌｉｇｏ２またはＳｏｘ１０の発現により示すことができる。
【００１０】
本開示の別の態様は、次のステップ：
ａ）培地を含むコーティングされた培養容器にＯＰＣを蒔くステップと、
ｂ）細胞が、分枝細胞突起（branched cell process）を伴って出現する、および／ま
たはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、ステップａ）の細胞を培養するステップと
に基づいて、オリゴデンドロサイトをＯＰＣから生成するための方法である。本方法の実施形態では、ステップａ）～ｃ）に使用する培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭまたはＭＥＭａから選択される。培地には、ＫＳＲ、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数を補充し得る。別の実施形態では、ステップａ）のＯＰＣは、６ウェルプレートを使用して１ウェルあたり約０．７５×１０
５
細胞～約１．５×１０
６
細胞で播種する。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞～約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。別の実施形態では、ステップｂ）の細胞は、約７～約３０日間培養し、この時に分枝細胞突起を有する細胞が存在する。別の実施形態では、ステップａ）の細胞培養容器は、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ－ラミニンでコーティングされている。
（【００１１】以降は省略されています）

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