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公開番号2024068456
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-20
出願番号2022178923
出願日2022-11-08
発明の名称(R)-(-)又は(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法
出願人国立大学法人東京工業大学,帝人株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 7/62 20220101AFI20240513BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】(R)-(-)又は(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸を構成単位とするPHAを提供すること。
【解決手段】炭素源と、前駆物質としての(R)-(-)又は(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から(R)-(-)又は(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位を含むポリマーを採取する工程を含む、(R)-(-)又は(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法;(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位と3-ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は(R)-(-)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位と3-ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー;及び、(S)-(+)-3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸単位のホモポリマー。
【選択図】図5
特許請求の範囲【請求項１】
炭素源と、前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸との存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養し、得られた培養物から（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーを採取する工程を含む、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーの製造方法。
続きを表示（約 1,800 文字）【請求項２】
前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を構成単位として含むポリマーが、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．１～０．８ｇの範囲で添加して、それぞれ、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマー、又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率又は前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が８モル％以下である、方法。
【請求項５】
前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と３－ヒドロキシブタン酸単位とからなるコポリマーを光学純度１００％ｅｅで製造する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の、前記（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の分率が３５～６５モル％の範囲である、方法。
【請求項６】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり０．９～２．０ｇの範囲で添加する、請求項３に記載の方法であって、前記コポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
【請求項７】
前記前駆物質としての（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加して、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位のホモポリマーを光学純度９９％ｅｅ以上で製造する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆物質としての（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸を培養液１Ｌあたり２．１～７．０ｇの範囲で添加する、請求項２に記載の方法であって、前記ホモポリマー中の３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位が（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位と（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位とが混合した形態にあり、前記前駆物質の添加量の増加に伴い、前記混合形態中の（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位の割合が増加する、方法。
【請求項９】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子であって、前記アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸重合酵素がＮ末端から１４９番目のアスパラギンのセリンへの置換、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの置換を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ラルストニア（Ralstonia）属菌、及びシュードモナス（Pseuomonas）属菌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｒ）－（－）又は（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸単位を含むポリマーの製造方法、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸と３－ヒドロキシブタン酸とからなるコポリマー、又は（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸と３－ヒドロキシブタン酸とからなるコポリマー、（Ｓ）－（＋）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマー、及び、（Ｒ）－（－）－３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸のホモポリマーに関する。本発明はまた、前記ホモポリマー又はコポリマーを含む組成物、及び前記ホモポリマー又はコポリマーを含むプラスチック材料に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【０００３】
ポリエステルの加工工程において、ポリエステルの結晶化速度の高さは加工時間の短縮につながるため、非常に重要である。最も一般的なＰＨＡである、３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成単位とするホモポリマー（Ｐ（３ＨＢ））は、高結晶性であるために硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体が種々開発されてきた（非特許文献１～４）。
【０００４】
ところで、α炭素に側鎖を有するヒドロキシアルカン酸は、低温での溶融性など優れた加工特性を付与できる点から、非常に魅力的なポリマー単位である。
３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）は、そのα炭素にメチル基を有するため、α炭素上にキラル中心が存在する。したがって、ＰＨＡ材料として、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰのうちの一方のエナンチオマーを含むＰＨＡ（すなわち、キラルＰＨＡ）も製造可能である。
【０００５】
これまで、３Ｈ２ＭＰを構成単位とするＰＨＡとして、炭素源として３Ｈ２ＭＰを用い、アルカリゲネス属細菌を培養することにより３Ｈ２ＭＰ単位を含むポリマーの製造が試みられたが、得られたポリマーは約１０モル％の３Ｈ２ＭＰ単位を含むターポリマー又はテトラポリマーであった（非特許文献５）。最近になって、コマモナス・エスピー（Comamonas sp.）を用いて、３Ｈ２ＭＰから３Ｈ２ＭＰホモポリマー（Ｐ（３Ｈ２ＭＰ））が乾燥菌体の最大３７重量％で製造できることが報告されたが（非特許文献６）、Ｐ（３Ｈ２ＭＰ）のキラリティーについては不明であった。
【０００６】
また、乳酸は３Ｈ２ＭＰと同じα炭素にキラル中心を有するが、そのポリマーであるポリＬ－乳酸（ＰＬＬＡ）とポリＤ－乳酸（ＰＤＬＡ）は、ＰＬＬＡとＰＤＬＡとの存在比に依って、結晶性、熱安定性、機械的強度などの材料特性が変化することが知られている（非特許文献７）。
【０００７】
このように、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ単位又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ単位は、新たな材料特性を有するＰＨＡ材料としての可能性を有することが期待されるところ、これまでそのような報告は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
Tsuge T, Yano K, Imazu SI et al., Macromol Biosci 2005; 5: 112-7. DOI: 10.1002/mabi.200400152
Mizuno K, Ohta A, Hyakutake M et al., Polym Degrad Stab 2010; 95: 1335-9. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2010.01.033
Furutate S, Kamoi J, Nomura CT et al., NPG Asia Mater 2021; 13: 1-11. DOI: 10.1038/s41427-021-00296-x
Mierzati M, Mizuno S, Tsuge T., Polym Degrad Stab 2020; 178: 109193. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2020.109193.
D. O. I. YOSHIHARU and K. SHIRO, 1995 [Online]. Available: https://lens.org/183-171-147-994-58
C. M. Vermeer, L. J. Bons, and R. Kleerebezem, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 106, no. 2, pp. 605-618, 2022
L. Han, Q. Xie, J. Bao, G. Shan, Y. Bao, and P. Pan, Polym. Chem., vol. 8, no. 6, pp. 1006-1016, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、（Ｒ）－３Ｈ２ＭＰ又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むＰＨＡを製造することを目的とする。また、当該ＰＨＡを構成する３Ｈ２ＭＰのエナンチオマーの種類又はその存在比によってポリマーの材料特性がどのように変化するかを探索し、優れた材料特性を有するポリマーを製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、前駆物質としてのエナンチオマーである（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰ、及び炭素源の存在下に、微生物にポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が導入された形質転換体を培養することにより、（Ｒ）－又は（Ｓ）－３Ｈ２ＭＰを構成単位として含むポリマーが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。特に、添加する前駆物質の濃度によって、得られるポリマーのキラリティーが制御可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
（【００１１】以降は省略されています）

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