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公開番号2024019727
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-02-09
出願番号2023223638,2020525971
出願日2023-12-28,2018-11-09
発明の名称標的化CRISPR送達プラットフォーム
出願人ユニバーシティオブマサチューセッツ
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20240202BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】標的化CRISPR送達プラットフォームの提供。
【解決手段】本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度CRISPR遺伝子編集プラットフォームをもたらすNeisseria meningitidis Cas9系を利用する。さらに、本発明は、完全なsgRNA-Nme1Cas9ベクターをin vivo投与に対して適合性のアデノ随伴ウイルスプラスミドに挿入することを可能にする全長および短縮された単一ガイドRNA配列を組み入れる。さらに、1～4個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするII-C型Cas9オルソログが同定されている。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
短縮されたリピート：アンチリピート領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度（hyperaccurate）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームを
もたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、このＣａｓ９系の改善：例えば、単一ガイドＲＮＡ配列を短縮すること、およびＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａ９をそのガイドＲＮＡと共にｉｎｖｉｖｏ投与に適合性のアデノ随伴ウイルスベクターに詰め込むことを組み入れる。さらに、１～４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ－Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
続きを表示（約 4,400 文字）【背景技術】
【０００２】
クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）は、古細菌および細菌に見いだされる、独特の、ＲＮＡをガイドとする適応免疫系である。これらの系は、外来遺伝子エレメントを起源とする核酸を標的とし、それを不活化することによって免疫をもたらすものである。現在まで多くの異なる型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が同定されており、２つのクラスにカテゴリー化されている。
【０００３】
クラスＩＩＣＲＩＳＰＲ系の中で、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成して、ＤＮＡを標的とし、それを切断する、Ｃａｓ９と称される単一のエフェクタータンパク質によって特徴付けられる。ｃｒＲＮＡは、生きている生物体内のほぼ全てのＤＮＡ配列にＣａｓ９を方向付けることができるプログラム可能なガイド配列を含有する。
【０００４】
このＣａｓ９ＲＮＰ複合体のプログラム可能性は、真核生物系におけるゲノム編集のために多くの研究者によって利用されてきた。これは、哺乳動物細胞、ヒト胚、植物、齧歯類、および他の生きている生物体のゲノムを編集するために使用されてきた。Ｃａｓ９
ＲＮＰは、どちらも遺伝子治療、農業、および他の場合に適用される、精密な（ドナー鋳型を用いる）ゲノム編集および厳密でないゲノム編集のために使用されてきた。さらに、ヌクレアーゼ失活バージョンのＣａｓ９オルソログが、転写モジュレーション、部位特異的ＤＮＡ標識付け、および特定のゲノム遺伝子座におけるプロテオームプロファイリングのために使用されている。いくつかの異なるＣａｓ９がこれらの適用のために使用されてきた。Ｃａｓ９のプログラム可能性、したがってその適用の中心となるのは、任意のガイド配列をｃｒＲＮＡに導入する能力である。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを一緒に融合して、より安定であり、かつゲノム編集の増強をもたらす単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。
【０００５】
特に、信頼できる核酸送達プラットフォームと組み合わせた場合に、より広い範囲の標的部位の特異的かつ正確な編集をもたらすことができる改善されたＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ配列が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームをもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、このＣａｓ９系の改善：例えば、単一ガイドＲＮＡ配列を短縮すること、およびＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａｓ９をそのガイドＲＮＡと共にｉｎｖｉｖｏ投与に適合性のアデノ随伴ウイルスベクターに詰め込むことを組み入れる。さらに、１～４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ－Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、短縮されたリピート：アンチリピート領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列を意図している。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたＳｔｅｍ２領域をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列またはＮｍｅ２Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、短縮されたＳｔｅｍ２領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列を意図している。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、単一ガイドリボ核酸－ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９（ｓｇＲＮＡ－Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡ－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）核酸ベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを意図している。一実施形態では、前記単一ガイドリボ核酸－ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９核酸ベクターは、少なくとも１つのプロモーターを含む。一実施形態では、前記少なくとも１つのプロモーターは、Ｕ６プロモーターおよびＵ１ａプロモーターからなる群より選択される。一実施形態では、前記単一ガイドリボ核酸－Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９核酸ベクターは、コザック配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子の配列と相補的な核酸配列を含む。一実施形態では、前記目的の遺伝子の配列は、ＰＣＳＫ９配列およびＲＯＳＡ２６配列からなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート－アンチリピート配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ２領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ２領域を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含む患者と、ｉｉ）単一ガイドリボ核酸－ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＣａｓ９（ｓｇＲＮＡ－Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡ－Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）核酸ベクターを含む送達プラットフォームであって、前記ｓｇＲＮＡが、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つの一部と相補的な核酸配列を含む、送達プラットフォームとを提供するステップと、ｂ）前記ＡＡＶプラスミドを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップとを含む方法を意図している。一実施形態では、送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。一実施形態では、送達プラットフォームは、微小粒子を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、高コレステロール血症を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、チロシン血症を含む。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの前記少なくとも１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＦＡＨ遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＦＡＨ遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート－アンチリピート配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ２領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ２領域を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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