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公開番号2023110919
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-08-09
出願番号2023060076,2019034085
出願日2023-04-03,2019-02-27
発明の名称生体高分子を認識するハイブリッド型蛍光プローブ
出願人公立大学法人福井県立大学,学校法人近畿大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類G01N 33/66 20060101AFI20230802BHJP(測定;試験)
要約【課題】糖類を含む生体高分子を高感度に蛍光認識できるハイブリッド型蛍光プローブとしてのBODIPY誘導体に関する。
【解決手段】式(1)の化合物またはその塩を含むプローブで、糖類をターゲットとした蛍光色素であるプローブ。
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【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
式（１）：
TIFF
2023110919000041.tif
44
60
［式中、
Ｒ
１
～Ｒ
４
は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＣＯＮＨ－アリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロシクリル、－ＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＣＯ－アリール、－ＣＯ－ヘテロアリール、または－ＣＯ－ヘテロシクリルであり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、カルボン酸、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
１－６
アルコキシ、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ
１
とＲ
２
、および／またはＲ
３
とＲ
４
が、それぞれの結合可能ないずれかの部位が結合して環を形成してもよく、および
Ｒ
５
は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
続きを表示（約 3,000 文字）【請求項２】
式（１）の化合物が式（２）：
TIFF
2023110919000043.tif
54
62
の化合物である、請求項１のプローブ。
【請求項３】
Ｒ
１
およびＲ
３
が水素原子である、請求項１または２のプローブ。
【請求項４】
Ｒ
２
およびＲ
４
がそれぞれ独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、または－ＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニルであり、ここでアルキルおよびアルケニルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、カルボン酸、およびＣ
１－６
アルコキシからなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、請求項１～３のいずれかのプローブ。
【請求項５】
Ｒ
２
およびＲ
４
がそれぞれ独立して、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキレン－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキルである、請求項３のプローブ。
【請求項６】
Ｒ
２
およびＲ
４
が、－ＮＨ－ＣＨ
２
ＣＨ
２
－Ｏ－ＣＨ
３
である、請求項５のプローブ。
【請求項７】
Ｒ
５
が、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、または－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、であり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、カルボン酸、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
１－６
アルコキシ、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル（ここで、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、更に適宜置換されていてもよいＣ
１－１２
アルキル、適宜置換されていてもよいベンジル、適宜置換されていてもよいアリール、適宜置換されていてもよいヘテロアリール、または適宜置換されていてもよいヘテロシクリルで置換されていてもよい）からなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、請求項１～６のいずれかのプローブ。
【請求項８】
Ｒ
５
が、水素原子、ニトロ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、または－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、であり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、カルボン酸、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
１－６
アルコキシ、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル（ここで、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、更に適宜置換されていてもよいＣ
１－１２
アルキル、適宜置換されていてもよいベンジル、適宜置換されていてもよいアリール、適宜置換されていてもよいヘテロアリール、または適宜置換されていてもよいヘテロシクリルで置換されていてもよい）からなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよい、請求項１～７のいずれかのプローブ。
【請求項９】
Ｒ
５
が、Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルキニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルキニル、または－ＣＯ－Ｃ
２－６
アルキニルである、請求項１～６のいずれかのプローブ。
【請求項１０】
Ｒ
５
が下式：
TIFF
2023110919000044.tif
15
33
（式中、Ｒ
６
はオリゴ糖認識構造であり、トリアゾール環の１位または３位の窒素原子に結合する）
である、請求項１～６のいずれかのプローブ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類を含む生体高分子を高感度に蛍光認識できるハイブリッド型蛍光プローブ、それを用いた解析方法、およびそれを調製するための合成中間体に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
糖類は生体関連分子に広く組み込まれる重要な分子単位であり、特に単糖が２～１０個結合した糖鎖であるオリゴ糖は、腸内環境の整備など、プレバイオティクスの観点からこれまでに多くの研究が報告されており、生理活性を利用した農薬、医薬品、食品添加物等への応用が期待されている。
【０００３】
糖類の定量分析は、従来、（１）フェノール－硫酸法のような、強酸と処理し色素化合物に導く比色定量法（非特許文献１）、（２）Somogyi-Nelson法のような、糖による還元で色素を発色させる比色定量法（非特許文献２および３）、（３）グルコースバイオセンサーとして広く用いられている酵素法、（４）ＨＰＬＣなどクロマトグラフィー法を示差屈折率（ＲＩ）検出法など各種検出法と組み合わせた分離検出法が用いられてきたが、感度や選択的な検出の点で課題があり、いずれもハイスループットアッセイには適していななど問題があった。
【０００４】
また、糖を蛍光誘導体化して検出する蛍光検出法として、リン酸－フェニルヒドラジン法やアルギニン試薬法も実施されているが、糖による誘導体化の反応性の違いや反応収率の影響で再現性のある解析が難しいという課題があった。
他に、糖鎖アレイ解析も実施されているが、アレイ解析によく用いられる蛍光色素Ｃｙ３を糖類の定量に用いた場合は、定量性には優れるが、量子収率が低く、蛍光色素としては不十分なため、検出感度に難があった。
【０００５】
一方、タンパク質の疎水性表面検出用の蛍光プローブとして、N. Dorhらが開発したHydrophobicity (HP) Sensorは、下記の母骨格ＢＯＤＩＰＹを有する蛍光プローブで、非極性溶媒中で高い量子収率と蛍光強度を示し、水溶液中では十分に消光するという特徴を有していた（非特許文献４）。しかしながら、糖類を解析するにあたっては、溶液中での蛍光の安定性に難があり、精密な蛍光定量には適さず、またプローブとしての選択性も不十分であった。
TIFF
2023110919000001.tif
27
35
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
Dubois, M. et al.: Anal. Chem., 28, 350 (1956)
P. A. Shaffer, M. Somogyi: J. Biol. Chem., 100, 695 (1933)
Nelson, N.: J. Biol. Chem., 153, 375 (1944)
N. Dorh, et al., Sci. Reports, 5, 18337 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、糖類、特にオリゴ糖を含む生体高分子を定量的に、且つ高感度に解析できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討したところ、タンパク質の解析に用いる蛍光色素の一種であるＢＯＤＩＰＹ（boron-dipyrromethene）の母骨格に水溶性を増大する置換基を導入し、更にジピロメテン骨格の５位に置換アリール基を導入することで、水溶液中ではほとんど蛍光を発しないことで知られたＢＯＤＩＰＹが、オリゴ糖と結合することで分子周辺で極性低下が生じ、その極性低下に応じて、水溶液中で強く飛躍的に安定な蛍光を発することを発見し、またアリール基の置換基として糖類選択的な官能基を導入することが可能となり、高感度で且つ各種糖類に対して選択的となり得るハイブリッド型蛍光プローブが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［項１］
式（１）：
TIFF
2023110919000002.tif
44
60
［式中、
Ｒ
１
～Ｒ
４
は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨ－アリール、－ＮＨ－ヘテロアリール、－ＮＨ－ヘテロシクリル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＮＨＣＯ－アリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロアリール、－ＮＨＣＯ－ヘテロシクリル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯＮＨ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＣＯＮＨ－アリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロアリール、－ＣＯＮＨ－ヘテロシクリル、－ＣＯ－Ｃ
１－６
アルキル、－ＣＯ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＣＯ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－ＣＯ－アリール、－ＣＯ－ヘテロアリール、または－ＣＯ－ヘテロシクリルであり、ここでアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、それぞれ独立して、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、カルボン酸、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
１－６
アルコキシ、Ｃ
３－８
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される１または２以上の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ
１
とＲ
２
、および／またはＲ
３
とＲ
４
が、それぞれの結合可能ないずれかの部位が結合して環を形成してもよく、および
Ｒ
５
は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アミン、チオール、エポキシ、カルボン酸、カルボン酸エステル、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルケニル、－Ｏ－Ｃ
２－６
アルキニル、－Ｏ－Ｃ
３－８
シクロアルキル、－Ｏ－アリール、－Ｏ－ヘテロアリール、－Ｏ－ヘテロシクリル、－ＮＨ－Ｃ
１－６
アルキル、－Ｎ（Ｃ
１－６
アルキル）
２
、－ＮＨ－Ｃ
２－６
アルケニル、－ＮＨ－Ｃ
【００１０】
［項２］
式（１）の化合物が式（２）：
TIFF
2023110919000004.tif
54
62
の化合物である、項１のプローブ。
（【００１１】以降は省略されています）

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