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公開番号2023079850
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-06-08
出願番号2021193522
出願日2021-11-29
発明の名称アデノ随伴ウイルスの分析方法
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12Q 1/70 20060101AFI20230601BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】
試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス(AAV)を高感度に分析する方法を提供すること。
【解決の手段】
試料中に含まれるAAVにAAV結合性タンパク質およびカルシウムイオンを添加し、前記AAVとAAV結合性タンパク質との結合親和性に基づき分析することで、前記課題を解決する。
【選択図】 図2
特許請求の範囲【請求項1】
試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス(AAV)をAAV結合性タンパク質との結合親和性に基づき分析する方法であって、前記AAVおよびAAV結合性タンパク質を含む溶液にカルシウムイオンを添加し分析する、前記方法。
続きを表示(約 710 文字)【請求項2】
AAV結合性タンパク質が、不溶性担体と当該担体に固定化したAAV結合性タンパク質とを含む吸着剤の態様である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
試料中に含まれるAAVを不溶性担体と当該担体に固定化したAAV結合性タンパク質とを含む吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤をカルシウムイオンを含む洗浄液を用いて洗浄する工程と、前記吸着剤に吸着したAAVをカルシウムイオンを含む溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
AAV結合性タンパク質が、以下の(i)から(iii)のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項1から3のいずれかに記載の方法;
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち312番目のセリンから500番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列の312番目のセリンから500番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該312番目から500番目までのアミノ酸残基において、1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつAAV結合活性を有するポリペプチド、
(iii)配列番号1に記載のアミノ酸配列の312番目のセリンから500番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該312番目から500番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有し、かつAAV結合活性を有するポリペプチド。

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス(AAV)の分析方法に関する。特に本発明は、前記AAVを、AAV結合性タンパク質との結合親和性に基づき分析する方法に関する。
続きを表示(約 1,400 文字)【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス(AAV)はパルボウイルス科(Parvoviridae)、ディペンドウイルス属(Dependovirus)に分類される非エンベロープウイルスである。AAV外殻粒子は3種類のタンパク質(VP1、VP2およびVP3)で構成されており、約60のタンパク質分子がおよそVP1:VP2:VP3=1:1:10の比率で混在し集合することで、直径20nmから30nmの正二十面体の形状をしている。
【0003】
自然界でのAAVは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、AAVゲノムは宿主細胞内で複製され、AAVゲノムを含む完全なAAV粒子が形成され、宿主細胞からAAV粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、AAVゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態(潜伏状態)となる。
【0004】
AAVはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【0005】
遺伝子組換えAAVベクター(以下、単にAAVベクターとも表記)の製造は、通常、AAV粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、AAVを産生する能力を有する細胞(以下、AAV産生細胞とも表記)を作製し、当該細胞を培養してAAV粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したAAVベクターはAAV産生細胞から回収精製し、治療用AAVベクター製剤を得る。
【0006】
AAVベクターの分析方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したAAV結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィによる方法があり、夾雑物質が共存したAAVベクターを含む試料から当該ベクターを分析できる(特許文献1)。しかしながら、特許文献1に記載の方法では、試料中に含まれるAAVベクターを高感度に分析するには不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
WO2021/106882号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルスを高感度に分析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、アデノ随伴ウイルス(AAV)およびAAV結合性タンパク質を含む溶液にカルシウムイオンを添加し分析することで、前記課題を解決できることを見出し、本発明の完成に至った。
【0010】
すなわち本発明は、以下の態様を包含する:
[1]試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス(AAV)をAAV結合性タンパク質との結合親和性に基づき分析する方法であって、前記AAVおよびAAV結合性タンパク質を含む溶液にカルシウムイオンを添加し分析する、前記方法。
(【0011】以降は省略されています)

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