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公開番号2023077481
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-06-06
出願番号2021190751
出願日2021-11-25
発明の名称ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質
出願人長瀬産業株式会社
代理人個人
主分類C12N 15/53 20060101AFI20230530BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本明細書では、放線菌を宿主とする発現系での発現に適した、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)活性を有するタンパク質、前記タンパク質を用いた基質の酸化方法、並びに、前記タンパク質を生産するための発現ベクター及び形質転換体を開示する。
【解決手段】本明細書は、ストレプトマイセス・ポプリ、ストレプトマイセス・ラウレンティ等の放線菌に由来する、BOD活性を有するタンパク質、前記タンパク質を触媒として用いて、所定のpH条件においてABTS、DMP、SGZ及びビリルビンを酸化する方法、並びに、プラスミドDNA中に前記タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAを含む発現ベクター、及び、前記発現ベクターが導入された形質転換を開示する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
放線菌に由来する、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記放線菌がストレプトマイセス・ポプリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｏｐｕｌｉ）である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１又は２に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記放線菌がストレプトマイセス・ラウレンティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ）である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
（ｃ）又は（ｄ）に記載のタンパク質である、請求項１又は４に記載のタンパク質：
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））を酸化する方法であって、
ｐＨ４．０～６．０の条件下で請求項２又は３に記載のタンパク質を触媒としてＡＢＴＳの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ３．５～６．０の条件下で請求項４又は５に記載のタンパク質を触媒としてＡＢＴＳの酸化反応を行うこと
を含む方法。
【請求項７】
ＤＭＰ（２，６－ジメトキシフェノール）を酸化する方法であって、
ｐＨ４．５～８．５の条件下で請求項２又は３に記載のタンパク質を触媒としてＤＭＰの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ５．０～８．５の条件下で請求項４又は５に記載のタンパク質を触媒としてＤＭＰの酸化反応を行うこと
を含む方法。
【請求項８】
ＳＧＺ（シリングアルダジン）を酸化する方法であって、
ｐＨ５．５～８．５の条件下で請求項２又は３に記載のタンパク質を触媒としてＳＧＺの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ６．０～８．５の条件下で請求項４又は５に記載のタンパク質を触媒としてＳＧＺの酸化反応を行うこと
を含む方法。
【請求項９】
ビリルビンを酸化する方法であって、
ｐＨ７．０～８．５の条件下で請求項２又は３に記載のタンパク質を触媒としてビリルビンの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ７．０～８．５の条件下で請求項４又は５に記載のタンパク質を触媒としてビリルビンの酸化反応を行うこと
を含む方法。
【請求項１０】
プラスミドＤＮＡ中に、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む、発現ベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明の一以上の実施形態は、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、前記タンパク質を用いてビリルビンオキシダーゼの基質を酸化する方法、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、並びに、前記発現ベクターが導入された形質転換体に関する。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）（ＥＣ：１．３．３．５）はビリルビンのビリベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。ＢＯＤは、反応液中の溶存酸素による、ビリルビン等の基質の酸化反応を触媒する。
【０００３】
ＢＯＤは、血清ビリルビン濃度の測定のための臨床検査薬に用いられる。ビリルビンはヘモグロビンの分解によって血液中に生じる色素であり、血清ビリルビン濃度は、肝疾患診断、黄疸鑑別等の診断における指標となる。
ＢＯＤの別の用途として、例えば、特許文献１に、バイオ燃料電池の酵素電極における用途が記載されている。
【０００４】
従来から利用されているＢＯＤの起源生物としては、ミロセシウム属菌（特許文献２、３）、イネいもち病菌（特許文献４）、バチラス・サチルス（特許文献５）が挙げられる。
【０００５】
一方、特許文献６では、放線菌においてタンパク質を発現するためのプラスミドベクターが記載されており、このプラスミドベクターに有用なタンパク質の遺伝子を組み込み、放線菌を宿主として前記タンパク質を効率的に生産できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
ＷＯ２０１８／１８５４１７
特開昭５７－１５９４８７号公報
特開２００４－８９０４２号公報
特表２０１４－５２３２３５号公報
特開２００６－６８００３号公報
特開２０１４－２０７８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
臨床検査薬用途のＢＯＤは高コストであるため、酵素電極等の他の用途での使用には適さないことがある。
【０００８】
本明細書では、放線菌を宿主とする発現系での発現に適した、ＢＯＤ活性を有するタンパク質、前記タンパク質を用いた基質の酸化方法、並びに、前記タンパク質を生産するための発現ベクター及び形質転換体を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）放線菌に由来する、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（２）前記放線菌がストレプトマイセス・ポプリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｏｐｕｌｉ）である、（１）に記載のタンパク質。
（３）（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、（１）又は（２）に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（４）前記放線菌がストレプトマイセス・ラウレンティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ）である、（１）に記載のタンパク質。
（５）（ｃ）又は（ｄ）に記載のタンパク質である、（１）又は（４）に記載のタンパク質：
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ、ビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（６）ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））を酸化する方法であって、
ｐＨ４．０～６．０の条件下で（２）又は（３）に記載のタンパク質を触媒としてＡＢＴＳの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ３．５～６．０の条件下で（４）又は（５）に記載のタンパク質を触媒としてＡＢＴＳの酸化反応を行うこと
を含む方法。
（７）ＤＭＰ（２，６－ジメトキシフェノール）を酸化する方法であって、
ｐＨ４．５～８．５の条件下で（２）又は（３）に記載のタンパク質を触媒としてＤＭＰの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ５．０～８．５の条件下で（４）又は（５）に記載のタンパク質を触媒としてＤＭＰの酸化反応を行うこと
を含む方法。
（８）ＳＧＺ（シリングアルダジン）を酸化する方法であって、
ｐＨ５．５～８．５の条件下で（２）又は（３）に記載のタンパク質を触媒としてＳＧＺの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ６．０～８．５の条件下で（４）又は（５）に記載のタンパク質を触媒としてＳＧＺの酸化反応を行うこと
を含む方法。
（９）ビリルビンを酸化する方法であって、
ｐＨ７．０～８．５の条件下で（２）又は（３）に記載のタンパク質を触媒としてビリルビンの酸化反応を行うこと、又は、
ｐＨ７．０～８．５の条件下で（４）又は（５）に記載のタンパク質を触媒としてビリルビンの酸化反応を行うこと
を含む方法。
（１０）プラスミドＤＮＡ中に、（１）～（５）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む、発現ベクター。
（１１）宿主細胞に、（１０）に記載の発現ベクターが導入された、形質転換体。
（１２）前記宿主細胞が放線菌である、（１１）に記載の形質転換体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一以上の実施形態に係るビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、放線菌を宿主とする発現系での発現が容易である。
（【００１１】以降は省略されています）

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