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公開番号2023073997
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-05-26
出願番号2022181704
出願日2022-11-14
発明の名称循環RNAプラットフォーム、その用途、および操作されたDNAからの製造プロセス
出願人マーティンウィリアムス,エスワイティーイー.バイオインコーポレイテッド
代理人弁理士法人信栄事務所
主分類C12N 15/63 20060101AFI20230519BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】遺伝子操作されたDNAから環状RNAを製造するプロセス、得られる真核細胞内での効率的な翻訳が可能な環状RNAプラットフォーム、およびそれらの使用を提供する。
【解決手段】操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドDNAであって、線形化制限酵素、細菌選択システム、および細菌複製起点を含む合成DNA骨格、ならびにRNAポリメラーゼプロモーター、環状化配列、5’DNAスペーサー、制限酵素認識配列を、特定の順序で含む、少環状RNAモジュール足場、翻訳開始配列、第2の制限酵素認識配列、少なくとも1つのコード配列、第3の制限酵素認識配列、3’DNAスペーサー、および2番目の環状化配列を含み、前記環状化配列は、核酸に相補的な相同領域配列および/またはRNAライゲーションが可能なタンパク質ベースのシステムを含む、操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドDNAを提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
以下を含む操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ：
少なくとも２つの線形化制限酵素（ＬＲＥ）、少なくとも１つの細菌選択システム、および少なくとも１つの細菌複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格、および；
少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼプロモーター、少なくとも１つの環状化配列（ｃｉｒｃＳＥＱ１）、少なくとも１つの５’ ＤＮＡスペーサー、少なくとも１つの制限酵素認識配列（ＭＣＳ１）を次の順序で含む、少なくとも１つの環状ＲＮＡモジュール足場、少なくとも１つの翻訳開始配列、少なくとも第２の制限酵素認識配列（ＭＣＳ２）、少なくとも１つのコード配列、少なくとも第３の制限酵素認識配列（ＭＣＳ３）、少なくとも１つの３’ＤＮＡスペーサー、および少なくとも１つの２番目の環状化シーケンス（ｃｉｒｃＳＥＱ２）；
ここで、前記環状化配列は、核酸に相補的な相同領域配列および／またはＲＮＡライゲーションが可能なタンパク質ベースのシステムを含み、前記システムは、ＲＮＡライゲーションＤＮＡｚｙｍｅ媒介環状化システム、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡからなる群から選択される、－リガーゼ媒介環状化システム、または自己スプライシングイントロン－エクソン媒介環状化システム。
続きを表示（約 3,100 文字）【請求項２】
細菌選択系が、細菌内で抗生物質耐性遺伝子を発現することができる転写ユニットを含む、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
【請求項３】
抗生物質耐性遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子。
【請求項４】
細菌の複製起点が、ｐＭＢ１起点、ｐＭＢ１＊誘導体起点、ｐＢＲ３２２起点、ＣｏｌＥ１起点、ＣｏｌＥ１＊派生起点およびＦ１起点からなる群から選択される、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
【請求項５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがウイルス性であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ４ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。ポリメラーゼプロモーター、およびＫ１１ＲＮＡポリメラーゼプロモーター。
【請求項６】
請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡであって、
－少なくとも１つの環状ＲＮＡモジュール足場の少なくとも２つの環状化配列の第１の環状化配列（ｃｉｒｃＳＥＱ１）は、少なくとも、第１の制限酵素認識配列（ＲＥ１Ａ）、第１の相同性領域（ＨＲ１Ｂ）に作動可能に連結されて構成される、置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループＩイントロン－エクソンシステムに由来するエクソンセグメント（エクソンＩ）およびイントロンセグメント（イントロンＩ）、第２の制限酵素認識配列（ＲＥ１Ｂ）、および第２の相同領域（ＨＲ１Ａ）。と、
－少なくとも１つの環状ＲＮＡモジュール足場の少なくとも２つの環状化配列の第２の環状化配列（ｃｉｒｃＳＥＱ２）は、少なくとも：第１の制限酵素認識配列（ＲＥ２Ａ）に作動可能に連結された第１の相同領域（ＨＲ２Ｂ）、置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループＩイントロン－エクソンシステムに由来するエクソンセグメント（エクソンＩＩ）およびイントロンセグメント（イントロンＩＩ）、２番目の相同領域（ＨＲ２Ａ）および２番目の制限酵素認識配列（ＲＥ２Ｂ）。
【請求項７】
請求項６に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡであって：
－第１の環状配列ｃｉｒｃＳＥＱ１の第１の相同領域ＨＲ１Ａは、第２の環状配列ｃｉｒｃＳＥＱ２の第２の相同領域ＨＲ２Ａに相補的である。と、
－第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第２の相同性領域ＨＲ１Ｂは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第１の相同性領域ＨＲ２Ｂに相補的である。
【請求項８】
少なくとも以下の工程を含む環状ＲＮＡの製造方法：
プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択する工程；
得られた組換え細菌を成長条件でのインキュベーションに供して、適切な分子量を生成するために操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの複製を可能にする。
得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を分離および精製する。
ライゲーションからなる群から適切なＲＮＡライゲーションシステムを選択すること；
精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを線形化制限酵素（ＬＲＥ）で消化する。
操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの線形化された環状ＲＮＡモジュール足場を精製します。
ＲＮＡ分子を生成するために、精製された線状化された環状ＲＮＡモジュール足場をインビトロ転写反応に供する工程；
線状ＲＮＡ分子を選択したＲＮＡライゲーションシステムにかける。と、
得られた環状ＲＮＡを精製します。
【請求項９】
ＲＮＡライゲーションシステムがＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムから選択される場合、ステップｄの後に、そのｃｉｒＳＥＱ領域（ｃｉｒｃＳＥＱ１およびｃｉｒｃＳＥＱ２）において親円形の共有結合的に閉じた合成プラスミドＤＮＡをトリミングするステップをさらに含む、請求項８に記載の環状ＲＮＡを製造するためのプロセス。ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９／リガーゼ。
【請求項１０】
請求項９に記載の環状ＲＮＡの製造方法であって、前記環状ＲＮＡの製造方法は、
ａ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡをＲＥ１Ａ制限酵素およびＲＥ１Ｂ制限酵素で消化して、エクソンＩ、イントロンＩ、およびＨＲ１Ｂセグメントを含む最初のｃｉｒｃＳＥＱ領域（ｃｉｒｃＳＥＱ１）内のＤＮＡの一部を除去し、続いてゲル化する－ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた線形化された親円形の共有結合的に閉じた合成プラスミドＤＮＡの電気泳動精製。
ｂ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを再結合します。
ｃ．ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択すること、
ｄ．得られたｃｉｒｃＳＥＱ１トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を分離および精製します。
ｅ．ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡをＲＥ２Ａ制限酵素およびＲＥ２Ｂ制限酵素で消化して、エクソンＩＩ、イントロンＩＩ、およびＨＲ２Ａセグメントを含む２番目のｃｉｒｃＳＥＱ領域（ｃｉｒｃＳＥＱ２）内のＤＮＡの一部を除去し、続いてゲル化します。ｃｉｒｃＳＥＱ１／２トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの電気泳動精製。
ｆ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１／２でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を再連結します。
ｇ．ｃｉｒｃＳＥＱ１／２でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に変換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択します。と
ｈ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡをｃｉｒｃＳＥＱ１／２トリミング領域で分離および精製します。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、環状ＲＮＡ分子を生成する可能性を有する遺伝子操作されたＤＮＡ技術に関し、特に、遺伝子操作されたＤＮＡから環状ＲＮＡを製造するプロセス、得られる真核細胞内での効率的な翻訳が可能な環状ＲＮＡプラットフォーム、およびそれらの使用に関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
リニアＲＮＡ
核酸コード化薬物の概念は、２０年以上前に、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をマウスの骨格筋に直接注入すると、コードされたタンパク質。当時、ｍＲＮＡはＤＮＡよりも安定性が低いため、ｍＲＮＡベースの医薬品は開発されていなかったため、この分野はＤＮＡベースの技術に焦点を当てていました。それにもかかわらず、ｍＲＮＡは１９６１年の発見以来、いくつかの疾患について一貫した研究の対象となってきました。
【０００３】
ｍＲＮＡの発見後の最初の数十年間、主な焦点は真核細胞内のこれらの分子の構造的および機能的側面と代謝を理解することでした。また、これらの数十年間で、ｍＲＮＡ工学用に作成されたいくつかのツールにより、これらの分子はより広範な研究コミュニティにとってよりアクセスしやすくなりました。１９９０年代に、ｍＲＮＡ分子の前臨床調査が開始され、その結果、長年にわたって蓄積されたこの知識により、最近の科学的および技術的進歩により、ｍＲＮＡに関連する障害のいくつかに対処し、克服することが可能になりました。高レベルのリサイクルまたはターンオーバーの対象となる生物学的分子の）および望ましくない免疫原性。
【０００４】
ＩＶＴｍＲＮＡベースの治療と、ｐＤＮＡなどの他の核酸ベースの治療との間には、いくつかの重要な違いがあります。ＩＶＴｍＲＮＡ分子は、機能するために核に入る必要はなく、細胞質に到達すると、これらの分子はすぐに翻訳されます。代わりに、ｐＤＮＡは核に到達してｍＲＮＡに転写される必要があり、ｍＲＮＡは次に細胞質に輸送されて翻訳される必要があります。さらに、ｐＤＮＡやウイルスベクターとは異なり、ｍＲＮＡは宿主ゲノムに組み込まれる可能性がないため、挿入変異誘発のリスクが回避されます。それは、真核生物のゲノムに豊富にあるが、異なる経路によって強くサイレンシングされる配列である転移因子のレトロトランスクリプターゼおよびインテグラーゼの作用によって媒介される非標準的なイベントによってのみ可能であり、この可能性は他の細胞ｍＲＮＡの可能性と同じです。．いくつかの医療および製薬用途では、ＩＶＴｍＲＮＡが短期間（約１週間）のみ活性であり、その後自然に完全に分解されることが有利です。さらに、ＩＶＴｍＲＮＡの製造は簡単で安価であるため、ＩＶＴｍＲＮＡベースの治療法が最近大きな関心を集めています。
【０００５】
ＩＶＴｍＲＮＡは、がん、感染症、心臓病学、内分泌学、および血液学の治療および予防分野において、広範な前臨床および臨床研究を受けてきました。ＩＶＴｍＲＮＡベースの治療法の背後にある主な概念は、特定の疾患状態を予防または変更するために患者の細胞、組織、または臓器に遺伝子コード配列を導入することです。
【０００６】
ＩＶＴｍＲＮＡを使用するには２つのアプローチがあります。１つのアプローチは、ＩＶＴｍＲＮＡをｅｘｖｉｖｏで患者の細胞に導入することです（たとえば、細胞が以前に患者の体から抽出されている場合）。そして、これらの一過性にトランスフェクトされた細胞は、患者に再投与されます。もう１つのアプローチは、筋肉内注射や腫瘍内送達などのさまざまな投与経路を使用して、ＩＶＴ－ｍＲＮＡ分子を患者の細胞にｉｎｖｉｖｏ投与することです。どちらのアプローチも、感染症などのいくつかの病気の治療と予防、またはがんなどの遺伝性疾患の治療に使用されています。
【０００７】
ｍＲＮＡ分子が細胞質内に入ると、薬理学的に活性な産物であるコード化されたタンパク質が、トランスフェクトされた細胞の自然な機構を使用して翻訳されます。ＩＶＴで生成されたｍＲＮＡは、真核細胞由来の天然に存在し、成熟し、処理された内因性ｍＲＮＡ分子に似るように設計されています。その結果、ＩＶＴｍＲＮＡは一本鎖であり、５’ キャップ、開始コドンと停止コドンが隣接し、非翻訳領域も隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持ち、最後に３’ ポリ（Ａ）テールを持ちます。これらの分子は、スプライシングが行われる細胞内区画である核を通過しないため、イントロンは望ましくありません。
【０００８】
は、線形化されたプラスミドまたは線形ＰＣＲ産物であるＤＮＡテンプレートからのｉｎｖｉｔｒｏ転写反応によって無細胞系で合成されます。ＤＮＡテンプレートは、５’ キャップを除くすべての構造要素と機能要素をエンコードします。ＩＶＴは、ヌクレオチドの存在下でＴ７、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼを用いて行うことができ、転写後、ワクシニアキャッピング酵素などのキャッピング酵素を用いてＲＮＡを酵素的にキャッピングする。次に、ＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅ消化に供し、得られたｍＲＮＡ分子を当技術分野で周知の方法によって精製する。
【０００９】
ＩＶＴｍＲＮＡの薬力学的活性は細胞質で行われます。核内で産生され、核外輸送によって細胞質に入る内因性ｍＲＮＡとは対照的に、ＩＶＴｍＲＮＡは細胞の外側から細胞質に入る必要があります。
【００１０】
ＩＶＴｍＲＮＡの細胞質バイオアベイラビリティは、細胞外空間に豊富に存在する非常に活性なユビキタスＲＮａｓｅと細胞膜による急速な分解によって制限され、負に帯電したｍＲＮＡ分子の細胞質への侵入を妨げます。真核細胞は、裸のｍＲＮＡ分子を積極的に飲み込むことができます。ただし、ほとんどの細胞タイプでは、この取り込み率は最小限です（１０，０００分子に１未満）。患者の細胞へのＩＶＴｍＲＮＡ分子のトランスフェクションは、ｍＲＮＡ分子をＲＮａｓｅによる分解から保護し、細胞取り込みプロセスにも役立つポリマーまたは脂質ナノ粒子と複合体を形成することにより、大幅に改善できます。あるいは、インビトロ、インビボ、および細胞へのエクスビボｍＲＮＡ導入に使用できるエレクトロポレーションなどの他の技術があります。
ＩＶＴｍＲＮＡが細胞質内に入ると、その薬理学は、内因性ｍＲＮＡの安定性と翻訳を調節するのと同じ複雑な細胞メカニズムによって支配されます。ＩＶＴｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドは、翻訳後修飾を受けることができ、その後、成熟タンパク質は生物活性化合物と見なされます。ＩＶＴｍＲＮＡおよびタンパク質産物の半減期は、ｍＲＮＡベースの治療薬物動態の重要な決定要因です。
（【００１１】以降は省略されています）

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