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公開番号2023071073
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-05-22
出願番号2021183664
出願日2021-11-10
発明の名称鋳型DNAの製造方法
出願人国立大学法人広島大学
代理人個人,個人
主分類C12Q 1/6806 20180101AFI20230515BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】sgRNAを試験管内転写で得るための鋳型DNAを多量、安価、簡便、且つ迅速に調製できるようにする。
【解決手段】鋳型DNAの製造方法は、カセット2本鎖DNAを準備する工程aと、標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程bと、それらをDNA結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程cと、該ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型DNAポリメラーゼにより増幅し、サポート配列と、RNAポリメラーゼのプロモーター配列と、標的配列と、sgRNAスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有2本鎖DNAを得る工程dと、該2本鎖DNAを同一配列同士の間で切断し、サポート配列とRNAポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とsgRNAスキャフォールド配列とからなる配列を有する鋳型DNAを得る工程eとを備えている。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡをセルフリークローニングシステムにより製造する方法であって、
（ａ）ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、サポート配列と、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とを含む断片からなり、両端に突出配列を有し且つ該断片の少なくとも一方の鎖の５’末端にリン酸基を含むカセット２本鎖ＤＮＡを準備する工程と、
（ｂ）前記カセット２本鎖ＤＮＡの前記突出配列に対して相補的な配列を有するカセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、所望のｓｇＲＮＡの標的配列とを有し、５’末端がリン酸化された標的配列含有オリゴヌクレオチドを調製する工程と、
（ｃ）前記カセット２本鎖ＤＮＡと前記標的配列含有オリゴヌクレオチドをＤＮＡ結合酵素により連結し、標的配列含有環状体ヌクレオチドを得る工程と、
（ｄ）前記標的配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、前記サポート配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記標的配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる反復配列を有する同一配列コンカテマーとなる標的配列含有２本鎖ＤＮＡを得る工程と、
（ｅ）工程ｄで得られた前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡを前記同一配列同士の間で切断し、サポート配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と標的配列とｓｇＲＮＡスキャフォールド配列とからなる配列を有する前記鋳型ＤＮＡを得る工程とを備える、鋳型ＤＮＡの製造方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、それぞれの鎖の５’末端に前記突出配列を有し、
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的配列含有２本鎖オリゴヌクレオチドは、前記カセット２本鎖ＤＮＡのリン酸化されている鎖と結合する前記オリゴヌクレオチド鎖の５’末端のみがリン酸化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、前記断片の一方の鎖の両端に前記突出配列を有し、
工程ｂにおける前記標的配列含有オリゴヌクレオチドは、前記標的配列の両端にそれぞれ前記カセット２本鎖ＤＮＡにおける前記突出配列の一方に相補的な第１カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列と、他方に相補的な第２カセット２本鎖ＤＮＡ結合配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列は、末端に制限酵素ＤｒａＩサイト又は制限酵素ＢｔｇＺＩサイト、及びＰＡＭ配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記カセット２本鎖ＤＮＡの、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列及び前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列の末端にそれぞれ結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により得る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーが、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に耐性を有するプライマーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｅにおける前記標的配列含有２本鎖ＤＮＡの切断は、前記制限酵素ＤｒａＩサイト又は前記制限酵素ＢｔｇＺＩサイトに対応する制限酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる切断である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
工程ａにおける前記カセット２本鎖ＤＮＡは、
（ａ１）サポート配列とベース配列とを含むベース配列含有２本鎖ＤＮＡを準備する工程であって、前記ベース配列は、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と、前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、前記ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列と前記ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列との間に配置され且つ両端に制限酵素サイトを有する可変領域の配列とからなる、工程と、
（ａ２）前記可変領域の前記制限酵素サイトを制限酵素により切断して前記カセット２本鎖ＤＮＡを得る工程と、を含む方法により調製する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ１における前記ベース配列含有２本鎖ＤＮＡは、前記サポート配列と前記ベース配列とを有するベース配列含有環状体ヌクレオチドを鋳型とする、前記サポート配列及び前記ベース配列の少なくとも一方に結合する２種類以上のプライマーを用いるローリングサークル型増幅により調製する、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型ＤＮＡの製造方法に関し、特にｓｇＲＮＡを試験管内転写で得るための鋳型ＤＮＡの製造方法に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、様々な生物種の遺伝子操作を可能にし、基礎研究のみならず、医学を含む応用研究にも影響を与えている。特に近年では、ゲノム編集のみならず、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）の検出等の応用利用も行われている。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用するためには、ｃｒＲＮＡ（ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ）が１つになったｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅＲＮＡ）を使用する必要がある。このｓｇＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼを使用して試験管内転写で作製する場合、対象配列毎に鋳型ＤＮＡを調製する必要がある。
【０００４】
現在この鋳型ＤＮＡの調製方法としては、プラスミドベクターへのクローニング又はＰＣＲ法で調製する方法が知られている。
【０００５】
非特許文献１には、プラスミドベクターへのクローニングによる、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）を得るための鋳型ＤＮＡの調製方法が開示されている。非特許文献１の調製方法では、初めに標的配列に対する２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成しておき、これらをアニーリングして２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを作製する。その後、該２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをベクターにライゲーションし、続いて形質転換及びダイレクトシークエンスによるポジティブクローンの選択を行うことで鋳型ＤＮＡを調製することができる。
【０００６】
非特許文献２には、ＰＣＲ法によるｓｇＲＮＡ用鋳型ＤＮＡの調製方法が開示されている。非特許文献２の調製方法では、標的配列を含むＤＮＡ、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部の３種類のオリゴＤＮＡを化学合成しておき、これらのオリゴＤＮＡをＰＣＲにより伸長させることで鋳型ＤＮＡを調製することができる。
【０００７】
また、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）人工遺伝子合成受託サービス等を利用して鋳型ＤＮＡを合成してもらうことも行われている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
「ゲノム編集｜２０２０」、フナコシ株式会社出版、フナコシニュース２０２０年５月１５日号（Ｎｏ．７０３）、ｐ．１－４０（ｐ．１６の右カラム）
「ガイドＲＮＡ合成キットＣＵＧＡ（登録商標）７ｇＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ別冊「参考資料」」、株式会社ニッポンジーン出版、製品マニュアル、改訂版Ｒ３０２、ｐ．１－１１（ｐ．３、４）
塚本智史著「クローニング不要！ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）－ｂａｓｅｄＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるノックアウトマウスの作製」、株式会社医学生物学研究所出版、ＩＤＴテクニカルレポート、ｖｏｌ．１、ｐ．１－６（ｐ．３の図１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１に記載されているプラスミドベクターへのクローニングによる鋳型ＤＮＡの調製方法では、形質転換及びダイレクトシークエンスによるポジティブクローンの選択に時間を要するため、鋳型ＤＮＡを調製するまでに数日程度の時間を要する。また、細胞を扱う必要があるため、ｇＲＮＡ製造のハイスループット化に適していない。
【００１０】
また、非特許文献２に記載されているＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの調製では、Ｔ７プロモーター配列と、標的配列と、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部とを有する上記標的配列を含むＤＮＡを化学合成する必要があるため、鋳型ＤＮＡを調製するまでに数日程度の時間が必要とされている。また、ＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの調製方法では、合成した鋳型ＤＮＡの塩基配列の正確性に欠けることがあるため、この鋳型ＤＮＡから作製するｓｇＲＮＡが所望の機能を果たさないこともあり得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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