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公開番号2023069350
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-05-18
出願番号2021181139
出願日2021-11-05
発明の名称抗体の製造方法及び抗体
出願人シスメックス株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12P 21/08 20060101AFI20230511BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】動物細胞を用いるタンパク質発現系による、フレームワーク領域3の少なくとも3つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体の製造において、抗体の収量を増加する手段を提供することを課題とする。
【解決手段】抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、動物細胞に抗体を産生させることにより、上記の課題を解決する。
【選択図】図11
特許請求の範囲【請求項1】
抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、前記動物細胞に前記抗体を産生させることを含み、
前記ポリアニオン性化合物が、アニオン性多糖及びアニオン性ポリアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1であり、
前記抗体が、フレームワーク領域3(FR3)の少なくとも3つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体である、抗体の製造方法。
続きを表示(約 850 文字)【請求項2】
前記アニオン性多糖が、硫酸化多糖又はアルギン酸塩である請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記硫酸化多糖が、デキストラン硫酸及びその塩、グリコサミノグリカン、及び、硫酸基を含むプロテオグリカンからなる群より選択される少なくとも1である請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ペントサン硫酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1である請求項3に記載の方法。
【請求項5】
前記硫酸基を含むプロテオグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1が共有結合したタンパク質である請求項3又は4に記載の方法。
【請求項6】
前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1である請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリアニオン性化合物を0.05 mg/mL以上20 mg/mL以下の濃度で含む培地で、前記動物細胞を培養する請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記抗体がIgGである請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
前記FR3の少なくとも3つのアミノ酸残基が、Chothia法で定義される軽鎖の63位、65位、67位、70位及び72位からなる群より選択される少なくとも3カ所の残基を含む請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体が、前記アミノ酸残基の置換をする前の抗体と比べて、抗原に対する親和性が向上した抗体である請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の製造方法及び抗体に関する。
続きを表示(約 5,700 文字)【背景技術】
【0002】
抗体の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を維持したまま、フレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を改変することにより、当該抗体の抗原に対する親和性を制御する技術が知られている。FRとは、抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれの可変領域に存在する、CDR以外の領域である。例えば、特許文献1には、抗体のFR3の少なくとも3つのアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基にすることにより、抗原に対する親和性を制御する方法が記載されている。特許文献1に記載の方法により得られる抗体は、医薬、体外診断薬、試薬などへの利用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
米国特許出願公開第2018/0179298号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明者らは、FR3の少なくとも3つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体を取得するため、当該抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞を従来の方法により培養した。しかし、得られた抗体の量は十分に満足できるものではなかった。本発明者らは、上記の抗体の収量を増加する手段を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【0005】
一般に、動物細胞を用いるタンパク質発現系による抗体の製造では、細胞培養の規模を拡大すれば、抗体の収量は増える。しかし、製造コストがかかる。本発明者らは、細胞培養の規模の拡大によらず、抗体の収量を増加する手段を検討した。その結果、本発明者らは、上記の抗体コードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養することにより、当該抗体の収量が増加することを見出して、本発明を完成した。
【0006】
本発明は、抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞をポリアニオン性化合物の存在下で培養して、動物細胞に抗体を産生させることを含み、ポリアニオン性化合物が、アニオン性多糖及びアニオン性ポリアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1であり、抗体が、FR3の少なくとも3つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体である、抗体の製造方法を提供する。また、本発明は、この製造方法により産生された抗体を提供する。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、動物細胞を用いるタンパク質発現系による抗体の製造において、上記の抗体の収量を増加することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(Viability)(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、グルコース、スクロース又はトレハロースを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム又はヘパリンナトリウムを添加した培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン硫酸ナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000又は50,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000、50,000又は500,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、分子量が5,000、50,000又は500,000のデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ヘパリンナトリウムを0.1、1又は10 mg/mLの濃度で含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリアスパラギン酸ナトリウム又はポリグルタミン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR5変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、デキストラン又はデキストラン硫酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの生存率(%)を示すグラフである。
リツキマシブを安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
リツキマシブのR3変異体を安定発現するCHO-S細胞株を、ポリプロリン又はアルギン酸ナトリウムを含む培地で培養したときの上清中の抗体濃度(mg/L)を示すグラフである。
トラスツズマブとその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
抗リゾチーム抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
抗インターロイキン(IL)-6抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
抗IL-8抗体とその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
リツキマシブとその変異体の抗原に対する親和性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本実施形態の抗体の製造方法では、生体外において、抗体をコードする遺伝子が導入された動物細胞を、ポリアニオン性化合物の存在下で培養して、当該動物細胞に抗体を産生させる。ここで、動物細胞に導入された遺伝子がコードする抗体及び動物細胞により産生される抗体は、FR3の少なくとも3つのアミノ酸残基がアルギニン残基又はリジン残基に置換された抗体(以下、「変異体」ともいう)である。
【0010】
本明細書において「抗体」は、IgG、IgA、IgM、IgD及びIgEのいずれであってもよいが、好ましくはIgGである。IgGを製造する場合、抗体をコードする遺伝子として、全長の軽鎖をコードする遺伝子と、全長の重鎖をコードする遺伝子とが組み込まれた動物細胞発現用ベクターを用いることが好ましい。「抗体」は抗体断片であってもよい。抗体断片は、軽鎖の可変領域を含むことが好ましい。そのような抗体断片としては、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、ドメイン抗体(dAb)、還元型IgG(rIgG)、ダイアボディ、トリアボディなどが挙げられる。
(【0011】以降は省略されています)

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