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公開番号2023068351
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-05-17
出願番号2021179373
出願日2021-11-02
発明の名称検体中の核酸を回収する方法
出願人愛知県
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 15/10 20060101AFI20230510BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】環境水や土壌中に含まれるDNAを簡易な装置でろ過分離および抽出する技術を提供することを目的とする。
【解決手段】水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む、検体中の核酸を回収する方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む、検体中の核酸を回収する方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグを使用して実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数個のサンプリングバッグを並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具を使用して実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数個のＤＮＡろ過器具を並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
微細な編み目構造を有するシートの目開きが、０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍである、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
核酸を吸着させるためのガラス繊維が、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものである、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布が、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境水や土壌中に含まれるＤＮＡを簡易な装置でろ過分離および抽出する技術に関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
環境ＤＮＡを環境水からろ過、分離、抽出する方法は、一般社団法人環境ＤＮＡ学会発行の環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル（非特許文献１）に詳細が記載されている。非特許文献１のマニュアルでは、環境水１Ｌから環境ＤＮＡをろ過、分離する方法として、カートリッジ式のフィルターを用いる方法と、ガラス繊維ろ紙を用いる方法の２種類が定義されている。いずれの方法もリアルタイムＰＣＲ法または次世代シーケンサーによる分析を前提としており、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりＤＮＡを抽出する。
【０００３】
上記した環境ＤＮＡのろ過、分離法は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が、カオトロピックの塩の存在下でガラス、シリカゲル、石英ウール、シリカ、ガラス膜又はポリマーなどに吸着する原理を利用したものであり、この原理は一般的に広く知られている。この原理を利用したＤＮＡを抽出する方法としては、ガラス繊維またはガラス粉末を組み込んだカートリッジ式のフィルターによってＤＮＡを精製する方法（例えば、特許第３０４５９２２号公報）、電気泳動後のアガロースゲルからガラス粉末にＤＮＡを吸着させて回収する方法（例えば、特開昭５９－２２７７４４号公報）、ガラス粉末に生体試料のＤＮＡを吸着させて遠心分離により回収する方法（特開平０３－００７５８２号公報）などが報告されている。また、ＤＮＡをシリカ粒子等の懸濁液に吸着させ、メンブレンフィルター上で回収する方法（特許第２６８０４６２号公報及び特開平１０－１５５４８１号公報）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特許第３０４５９２２号公報
特開昭５９－２２７７４４号公報
特開平０３－００７５８２号公報
特許第２６８０４６２号公報
特開平１０－１５５４８１号公報
【非特許文献】
【０００５】
一般社団法人環境ＤＮＡ学会（２０２０）環境ＤＮＡ調査・実験マニュアルｖｅｒ．２．２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した特許文献１～５に記載されているカオトロピック物質にＤＮＡを吸着させて回収する方法は、微量または少量のＤＮＡ溶液を対象としていることから、有機物を含む浮遊物に汚染された清浄ではない水を１Ｌ程度ろ過する必要がある一般的な環境ＤＮＡ分析には適用できない。
【０００７】
環境水を対象とする「環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル」（非特許文献１）に記載の方法においても、１Ｌを目詰まりさせることなくろ過することはしばしば困難である。同時に、これら従来の方法はいずれも施設の整った実験室で実施する必要があり、広範囲の環境ＤＮＡ調査の物理的な妨げとなっていた。そこで、環境水を実験施設に持ち帰ることなく、採水現場で多量の環境ＤＮＡのろ過分離を可能とする技術の開発が求められていた。
【０００８】
本発明は、上述の課題を解決するためになされたものである。即ち、本発明は、簡易な装置で環境ＤＮＡをろ過分離および抽出する方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させ、それらのガラス繊維を微細な編み目構造を有するシートで回収することにより、簡易に検体中の核酸をろ過及び分離できることを見出した。本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１０】
＜１＞水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む、検体中の核酸を回収する方法。
＜２＞核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグを使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞複数個のサンプリングバッグを並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜２＞に記載の方法。
＜４＞液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜２＞又は＜３＞に記載の方法。
＜５＞核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具を使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜６＞複数個のＤＮＡろ過器具を並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜５＞に記載の方法。
＜７＞液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜５＞又は＜６＞に記載の方法。
＜８＞微細な編み目構造を有するシートの目開きが、０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞核酸を吸着させるためのガラス繊維が、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものである、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布が、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％である、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法により検体中の核酸を回収する工程、及び
回収した核酸を用いて、ＬＡＭＰ法によりＤＮＡの増幅を行う工程、
を含む、環境ＤＮＡの検出方法。
＜１２＞（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグ。
＜１３＞液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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