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公開番号2023038910
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-03-17
出願番号2022123946,2021145726
出願日2022-08-03,2021-09-07
発明の名称核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
出願人国立大学法人千葉大学,株式会社ベックス
代理人個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20230310BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】PAM配列、PFS配列に依存しない核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法を提供する。
【解決手段】RNA2および融合タンパク質3を含む核酸配列改変用組成物であって、RNAは、核酸配列の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域21と、融合タンパク質をガイドするガイド領域22と、を含み、ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域23を含み、融合タンパク質は、RNAの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメイン31と(但し、結合ドメインがCasタンパク質群のRNA認識領域を含むことを除く。)、核酸配列の標的部位を改変する改変ドメイン32と、を含む核酸配列改変用組成物。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
ＲＮＡおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、
ＲＮＡは、
核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
を含み、
ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
融合タンパク質は、
ＲＮＡの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと（但し、結合ドメインがＣａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除く。）、
核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
を含む
核酸配列改変用組成物。
続きを表示（約 740 文字）【請求項２】
ガイド領域が、認識領域を２つ含む
請求項１に記載の核酸配列改変用組成物。
【請求項３】
ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第１相補領域を含み、
第１相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
請求項１または２に記載の核酸配列改変用組成物。
【請求項４】
ガイド領域が、ステムループを含む
請求項１～３の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
【請求項５】
結合ドメインが、ＮｏｖａのＲＮＡ結合領域を含み、
改変ドメインが、ゲノムＤＮＡを切断するＦｏｋＩの開裂領域を含む
請求項１～４の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
【請求項６】
核酸配列が、ゲノムＤＮＡである
請求項１～５の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
【請求項７】
請求項１～６の何れか一項に記載のＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸、および、
請求項１～６の何れか一項に記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
を含む
核酸配列改変用組成物。
【請求項８】
請求項１～６の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸。
【請求項１０】
請求項１～６の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本出願における開示は、核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法に関する。
続きを表示（約 3,500 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生物種において、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する技術であるゲノム編集が注目されている。ゲノム編集方法としては、例えば、（１）ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｒｒａｙ）と非特異的なＤＮＡ切断ドメイン（Ｎｕｃｌｅａｓｅｄｏｍａｉｎ）とを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にＤＮＡ中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１、図１Ａ参照）、（２）植物病原菌キサントモナス属が有するＤＮＡ結合モジュールである転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターと、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅｄｏｍａｉｎ）と、を連結したＴＡＬＥＮを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２、図１Ｂ参照）、が知られている。
【０００３】
しかしながら、図１Ａに示すように、上記特許文献１に記載の方法はゲノムＤＮＡを認識するドメイン（Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｒｒａｙ）が２つ必要であり、それぞれ、タンパク質で形成されている。そして、ゲノムＤＮＡを認識する２つのドメインは、それぞれ、二本鎖ＤＮＡの標的部位から３’側を認識するように設計されている。したがって、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する際には、配列が異なる一対のＺｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｒｒａｙの設計が必要であるという問題がある。
【０００４】
また、図１Ｂに示すように、上記特許文献２に記載の方法は、ゲノムＤＮＡを認識するドメイン（ＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒ）の方向が、二本鎖ＤＮＡの標的部位から５’側である点で特許文献１に記載の方法と異なる。しかしながら、特許文献１に記載の方法と同様に、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する際には、配列が異なる一対のＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒの設計が必要であるという問題がある。
【０００５】
一方、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する技術として、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が注目されている（特許文献３～６参照）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、図２に示すように、改変したいＤＮＡと相補的な配列を有するガイドＲＮＡと、ガイドＲＮＡと複合体を形成するキャス９タンパク質で構成されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイドＲＮＡは、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを認識して相補対を形成すればよい。したがって、上記特許文献１および２と異なり、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変するＮｕｃｌｅａｓｅｄｏｍａｉｎをガイドするガイドＲＮＡは一つでよいというメリットがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特許第４９６８４９８号公報
特表２０１３－５１３３８９号公報
特表２０１５－５２７８８９号公報
特表２０１６－５００２６２号公報
特表２０１６－５０１５３１号公報
特表２０１６－５０１５３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献３～６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた方法は、図２に示すように、ゲノムＤＮＡのＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’等）の３～４塩基上流側の塩基がＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断される。つまり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた方法は、ゲノムＤＮＡの標的部位がＰＡＭ配列の近傍に制限されるという問題がある。また、Ｃａｓ１３を用いることでＲＮＡを改変することも知られているが、その場合も、標的部位がＰＦＳ（ＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒＦｌａｎｋｉｎｇＳｉｔｅ）配列の近傍に制限されるという問題がある。
【０００８】
本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたもので、鋭意研究を行ったところ、（１）ハイブリダイズ領域および認識領域を含むＲＮＡと、（２）認識領域と複合体を形成する融合タンパク質と、を用いることで、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく、核酸配列を改変できることを新たに見出した。すなわち、本出願における開示の目的は、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存しない核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）ＲＮＡおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、
ＲＮＡは、
核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
を含み、
ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
融合タンパク質は、
ＲＮＡの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと（但し、結合ドメインがＣａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除く。）、
核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
を含む
核酸配列改変用組成物。
（２）ガイド領域が、認識領域を２つ含む
上記（１）に記載の核酸配列改変用組成物。
（３）ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第１相補領域を含み、
第１相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
上記（１）または（２）に記載の核酸配列改変用組成物。
（４）ガイド領域が、ステムループを含む
上記（１）～（３）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（５）結合ドメインが、ＮｏｖａのＲＮＡ結合領域を含み、
改変ドメインが、ゲノムＤＮＡを切断するＦｏｋＩの開裂領域を含む
上記（１）～（４）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（６）核酸配列が、ゲノムＤＮＡである
上記（１）～（５）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（７）上記（１）～（６）の何れか一つに記載のＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸、および、
上記（１）～（６）の何れか一つに記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
を含む
核酸配列改変用組成物。
（８）上記（１）～（６）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡ。
（９）上記（７）に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸。
（１０）上記（１）～（６）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
（１１）上記（７）に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸。
（１２）核酸配列の標的部位を改変する方法であって、該方法は、
上記（１）～（７）の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を細胞に導入する導入工程と、
改変ドメインが核酸配列の標的部位を改変する改変工程と、
を含む
核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１３）導入工程の前に、核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含む
上記（１２）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１４）一つの標的部位を改変するために必要なハイブリダイズ領域が一つである、
上記（１２）または（１３）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１５）ガイド領域が、認識領域を２つ含む
上記（１４）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１６）導入工程の前に、核酸配列の改変に必要な数の融合タンパク質と複合体を形成できるように、認識領域の数およびＲＮＡ配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含む、
上記（１５）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本出願で開示する核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法により、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく核酸配列を改変できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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