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公開番号2022138144
公報種別公開特許公報(A)
公開日2022-09-22
出願番号2022034949
出願日2022-03-08
発明の名称組換えAAV9ビリオンの製造方法
出願人JCRファーマ株式会社
代理人個人,個人
主分類C12N 15/864 20060101AFI20220914BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】空ウイルスの混入の少ない組換えアデノ随伴ウイルス粒子(rAAVビリオン)の製造方法を提供すること。
【解決手段】rAAV9ビリオンの製造方法であって;(a)AAVベクターが導入された哺乳動物細胞を培地中で培養して該培地中にrAAV9ビリオンを放出させ,(b)該培地から培養上清を回収し,(c)該回収した培養上清から,AAVのカプシド蛋白質に親和性を有する材料を固定相として用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーと,陰イオンカラムクロマトグラフィーとを用いて,rAAV9ビリオンを精製する,ことを含む製造方法。
【選択図】図6
特許請求の範囲【請求項1】
rAAV9ビリオンの製造方法であって;
(a)AAVベクターが導入された哺乳動物細胞を培地中で培養して該培地中にrAAV9ビリオンを放出させ,
(b)該培地から培養上清を回収し,及び
(c)該回収した培養上清から,AAVのカプシド蛋白質に親和性を有する材料を固定相として用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーと,陰イオン交換体を固定相として用いた陰イオンカラムクロマトグラフィーとを用いて,該rAAV9ビリオンを精製する,
ことを含む製造方法。
続きを表示(約 840 文字)【請求項2】
該アフィニティカラムクロマトグラフィーに用いられる固定相が血清型9のAAVのカプシド蛋白質に対し特異的な親和性を有するものである,請求項1に記載の製造方法。
【請求項3】
該陰イオン交換体が強陰イオン交換体である,請求項1又は2に記載の製造方法。
【請求項4】
該強陰イオン交換体が,第4級アミンを有するものである,請求項3に記載の製造方法。
【請求項5】
該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて,該rAAV9ビリオンを該陰イオン交換体に吸着させ,次いで第四級アンモニウム塩を含有する緩衝液により該rAAV9ビリオンを該陰イオン交換体から溶出させて,該rAAV9ビリオンを含む画分を回収するものである,請求項1~4の何れかに記載の製造方法。
【請求項6】
該緩衝液のpHが,8.5~10.5である,請求項5に記載の製造方法。
【請求項7】
該緩衝液に含まれる緩衝剤が,トリス塩酸,ビス-トリス,ビス-トリスプロパン,ビシン(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン),HEPES(4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸),TAPS(3-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンエタンスルホン酸),トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン),及びこれらの任意の2種以上を組み合わせたものからなる群から選択されるものである,請求項5又は6に記載の製造方法。
【請求項8】
該緩衝液に含まれる緩衝剤が,ビス-トリスプロパンである,請求項5又は6に記載の製造方法。
【請求項9】
該緩衝剤の濃度が10mM~30mMである,請求項7又は8に記載の製造方法。
【請求項10】
該緩衝液が,中性塩を含むものである,請求項5~9の何れかに記載の製造方法。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は,遺伝子治療のために用いることのできる組換えアデノ随伴ウイルス粒子(rAAVビリオン)を製造するための方法に関し,例えば,アフィニティカラムクロマトグラフィーと,陰イオンカラムクロマトグラフィーとを用いてrAAV9ビリオンを精製する工程を含むrAAV9ビリオンの製造方法に関する。
続きを表示(約 1,900 文字)【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス(AAV: adeno-associated virus)は,自然界に存在するウイルスの中で最も小さい部類の直鎖一本鎖DNAウイルスであるパルボウイルス科に属し,そのウイルスゲノムは約4.7 kbである。エンベロープを持たず,直径約22 nmの正二十面体粒子を形成する。
【0003】
AAVには,セロタイプと呼ばれる血清型が異なる変異種が多数存在し,それらの中の11種類のセロタイプがヒト細胞に感染することが知られている。AAVの各セロタイプはそれぞれ特有の臓器への指向性を持つ。例えば,AAV9は,中枢神経系(CNS),心臓,肺,肝臓,骨格筋に指向性を持って感染することが知られている。
【0004】
AAVはヒトの多様な臓器に感染するものの,病原性はないと考えられている。従って,AAVを遺伝子治療用の組換えウイルスを製造するための材料として利用することが試みられている。AAVの各セロタイプは感染する臓器にそれぞれ指向性があるので,遺伝子治療により遺伝子を導入させるべき臓器によって,セロタイプを使い分けることも試みられている。AAV9は,中枢神経系(CNS),心臓,肺,肝臓,骨格筋に指向性があるので,これらの臓器,組織に遺伝子を導入するための組換えウイルスを製造するための材料として利用することも試みられている。
【0005】
AAVを応用した遺伝子治療において,野生型のAAVゲノムの一部を外来の遺伝子に置換させた組換えAAVゲノム(rAAVゲノム)がカプシド蛋白質に内包された組換えAAVビリオン(rAAVビリオン)の形態で患者に投与される。rAAVビリオンは,野生型のAAVゲノムがカプシド蛋白質に内包されて野生型AAVが形成されるプロセスを試験管内で行わせることで製造される。この過程で,rAAVゲノムがカプシド蛋白質に内包されてrAAVビリオンが形成されるが,rAAVビリオンを内包しない空の粒子(空カプシド)も形成される。特にプラスミドDNAの一過性発現系では80%近くの空カプシドが含まれるとの報告もある。(非特許文献1)。空カプシドは遺伝子治療のために用いるrAAVビリオンの製造過程で生じる不純物である。
【0006】
空カプシドを除去する方法としては,小規模スケールであれば,DNAを内包したrAAVビリオンとDNAを内包していない空カプシドを密度勾配超遠心により分離する方法が知られている(非特許文献2)。但し,AAVベクターを用いた遺伝子治療の治験において用いられているrAAVビリオンは,必ずしも空カプシドが除去されたものではなく,血友病B患者に対して実施された治験で実際に投与されたrAAVビリオン(scAAV2/8-FIX)は,空カプシドとrAAVビリオンの比率が約4:1と,rAAVビリオンが20%程度しか含まれていない(非特許文献1,非特許文献3)。
【0007】
スケールアップ可能な空カプシド除去方法としては陰イオン交換体を用いたカラムクロマトグラフィーが挙げられる(特許文献1)。また,2ステップのイオン交換カラムクロマトグラフィーにより,rAAV5(セロタイプが5型のrAAVビリオン)を空カプシドから分離する方法が報告されている(非特許文献4)。但し,この方法はrAAV2(セロタイプが2型のrAAVビリオン)に適用できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
特許第5956331号公報
【非特許文献】
【0009】
James A. Human Gene Therapy. 22. 595-604 (2011)
Ayuso E. Gene Therapy. 17. 503-510 (2010)
Maria S. Human Gene Therapy Methods. 28. 101-108 (2017)
Nicole B. Molecular Therapy. 6. 678-686 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は,遺伝子治療等において,所望の蛋白質をコードする遺伝子を細胞に導入するために用いることのできるrAAV9ビリオンの効率的な精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
(【0011】以降は省略されています)

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