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公開番号2022138142
公報種別公開特許公報(A)
公開日2022-09-22
出願番号2022034887
出願日2022-03-08
発明の名称抗体-リソソーム酵素融合蛋白質の製造方法
出願人JCRファーマ株式会社
代理人個人,個人
主分類C12P 21/02 20060101AFI20220914BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】抗体をリソソーム酵素と融合させた融合蛋白質の製造方法を提供すること。
【解決手段】抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって;(a)該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させ,(b)該培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収し,(c)該培養上清から,該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて,該融合蛋白質を精製する,ことを含んでなるものである,製造方法。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項1】
抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって;
(a)該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させ,
(b)該培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収し,
(c)該培養上清から,該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて,該融合蛋白質を精製する,
ことを含んでなるものである,製造方法。
続きを表示(約 860 文字)【請求項2】
該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと,該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと,該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと,及び該サイズ排除カラムクロマトグラフィーとを,この順で用いてなるものである,請求項1に記載の製造方法。
【請求項3】
該抗体に親和性を有する物質が,該抗体の重鎖のCH

領域に親和性を有するものである,請求項1又は2に記載の製造方法。
【請求項4】
該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が,強陰イオン交換体である,請求項1乃至3のいずれかに記載の製造方法。
【請求項5】
該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陽イオン交換体が,弱陽イオン交換体である,請求項1乃至4のいずれかに記載の製造方法。
【請求項6】
該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,ヒト化抗体又はヒト抗体である,請求項1乃至5のいずれかに記載の製造方法。
【請求項7】
該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,ヒト化抗体である,請求項1乃至5のいずれかに記載の製造方法。
【請求項8】
該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原とするものである,請求項1乃至7のいずれかに記載の製造方法。
【請求項9】
血管内皮細胞の表面に存在する該分子が,トランスフェリン受容体(TfR),インスリン受容体,レプチン受容体,リポ蛋白質受容体,IGF受容体,OATP-F,有機アニオントランスポーター,MCT-8,モノカルボン酸トランスポーター,及びFc受容体からなる群から選択されるものである,請求項8に記載の製造方法。
【請求項10】
該血管内皮細胞が脳血管内皮細胞である,請求項8に記載の製造方法。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は,抗体をリソソーム酵素と融合させた融合蛋白質の製造方法に関し,例えば,該融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより得られる組換え融合蛋白質を,医薬として利用できる純度にまで精製する方法に関する。
続きを表示(約 7,600 文字)【背景技術】
【0002】
現在,組換え蛋白質を有効成分として含有してなる多くの医薬が市販されている。このような組換え蛋白質は,目的の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより,培養上清中に得られたものである。培養上清中に得られた組換え蛋白質は,そのままでは夾雑物を含むので医薬として使用できない。医薬として使用するためには,培養上清中に含まれる組換え蛋白質を精製する必要がある。
【0003】
哺乳動物細胞を宿主細胞として用い,この宿主細胞を培養して培養上清中に得られた組換え蛋白質を,医薬として使用できるレベルにまで精製する方法が報告されている。例えば,赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させ赤血球の産生を促進する糖蛋白質であるヒトエリスロポエチン(hEPO)を,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清から色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献1)。また例えば,卵巣でのエストロゲンの生産及び分泌を促進する活性を有する性腺刺激ホルモンの一種であるヒト卵胞刺激ホルモン(hFSH)を,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献2)。また例えば,ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン(GAG)分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種であるヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(hI2S)を,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献3)。また例えば,糖脂質及び糖蛋白質の末端α-ガラクトシル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種であるヒトα-ガラクトシダーゼA(hα-Gal A)を,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清から陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献4,特許文献5)。更に例えば,DNAを塩基配列非特異的に分解する活性を有するヒトDNaseIを,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清から陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及び色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献6)。更に例えば,ヒトイズロン酸-2-スルファターゼと結合させた抗hTfR抗体を,宿主細胞としてCHO細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ,これを培養上清からプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィー,ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている(特許文献7)。
【0004】
このように,医薬として使用できる組換え蛋白質を取得するために,それぞれの組換え蛋白質について,独自の精製方法が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
特表2010-511378号公報
特開2009-273427号公報
特表2014-508506号公報
国際公開第2014/017088号
国際公開第2016/117341号
国際公開第2016/067944号
国際公開第2018/038243号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は,抗体とリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質を,組換え蛋白質として発現させて,これを医薬として市場に流通させることが可能な純度にまで精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記目的に向けた研究において,本発明者らは,鋭意検討を重ねた結果,抗トランスフェリン受容体抗体とヒトα-L-イズロニダーゼ(hIDUA)とを融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を無血清培地中で培養することにより,培養液中に得られる融合蛋白質を,該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーの組み合わせにより精製することによって,高い純度で効率よく精製することができることを見出した。本発明は,これらの知見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。すなわち,本発明は以下を提供する。
1.抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって,
(a)該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られた培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収するステップと,
(c)上記ステップ(b)で得られた培養上清から,該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて,該融合蛋白質を精製するステップと,
を含んでなるものである,製造方法。
2.該ステップ(c)において,該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと,陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと,及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを,この順で用いてなるものである,上記1の製造方法。
3.該抗体に親和性を有する物質が,該抗体の重鎖のCH

領域に親和性を有するものである,上記1又は2の製造方法。
4.該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が,強陰イオン交換体である,上記1乃至3のいずれかの製造方法。
5.該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陽イオン交換体が,弱陽イオン交換体である,上記1乃至4のいずれかの製造方法。
6.該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,ヒト化抗体又はヒト抗体である,上記1乃至5のいずれかの製造方法。
7.該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,ヒト化抗体である,上記1乃至5のいずれかの製造方法。
8.該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が,血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原とするものである,上記1乃至7のいずれかの製造方法。
9.血管内皮細胞の表面に存在する該分子が,トランスフェリン受容体(TfR),インスリン受容体,レプチン受容体,リポ蛋白質受容体,IGF受容体,OATP-F,有機アニオントランスポーター,MCT-8,モノカルボン酸トランスポーター,及びFc受容体からなる群から選択されるものである,上記8の製造方法。
10.該血管内皮細胞が脳血管内皮細胞である,上記8の製造方法。
11.該脳血管内皮細胞の表面に存在する分子が,トランスフェリン受容体(TfR),インスリン受容体,レプチン受容体,リポ蛋白質受容体,IGF受容体,OATP-F,有機アニオントランスポーター,MCT-8,及びモノカルボン酸トランスポーターからなる群から選択されるものである,上記10の製造方法。
12.該血管内皮細胞が,ヒトの血管内皮細胞である,上記8乃至11のいずれかの製造方法。
13.該抗体が,抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって,
該抗体が重鎖の可変領域において,CDR1が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,及びCDR3が配列番号17又は配列番号18のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該抗体が軽鎖の可変領域において,CDR1が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号10若しくは配列番号11のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,及びCDR3が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記1乃至12のいずれかの製造方法。
14.該抗体が,重鎖のフレームワーク領域3が配列番号19のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13の製造方法。
15.該抗体における該重鎖の可変領域が,配列番号21のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記14の製造方法。
16.該抗体が重鎖の可変領域において,配列番号21のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR3が配列番号17又は配列番号18のアミノ酸配列を含んでなり,及び
フレームワーク領域3が配列番号19のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13又は14の製造方法。
17.該抗体が重鎖の可変領域において,配列番号21のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR3が配列番号17又は配列番号18のアミノ酸配列を含んでなり,及び
フレームワーク領域3が配列番号19のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13又は14の製造方法。
18.該抗体が重鎖の可変領域において,配列番号21のアミノ酸配列に対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR3が配列番号17又は配列番号18のアミノ酸配列を含んでなり,及び
フレームワーク領域3が配列番号19のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13又は14の製造方法。
19.該抗体が重鎖の可変領域において,配列番号21のアミノ酸配列に対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR3が配列番号17又は配列番号18のアミノ酸配列を含んでなり,及び
フレームワーク領域3が配列番号19のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13又は14の製造方法。
20.該抗体における軽鎖の可変領域が,配列番号20のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13乃至19のいずれかの製造方法。
21.該抗体が軽鎖の可変領域において,配列番号20のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号10若しくは配列番号11のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,
CDR3が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13乃至19のいずれかの製造方法。
22.該抗体が軽鎖の可変領域において,配列番号20のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号10若しくは配列番号11のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,
CDR3が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13乃至19のいずれかの製造方法。
23.該抗体が軽鎖の可変領域において,配列番号20のアミノ酸配列に対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号10若しくは配列番号11のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,
CDR3が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13乃至19のいずれかの製造方法。
24.該抗体が軽鎖の可変領域において,配列番号20のアミノ酸配列に対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ
CDR1が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,
CDR2が配列番号10若しくは配列番号11のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,
CDR3が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記13乃至19のいずれかの製造方法。
25.該抗体の該重鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含むものである,上記15の製造方法。
26.該抗体の該軽鎖が,配列番号22のアミノ酸配列を含むものである,上記20又は25の製造方法。
27.該抗体がFab,F(ab’)

,又はF(ab’)である,上記1乃至26のいずれかの製造方法。
28.該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が,該抗体の軽鎖のC末端側又はN末端側に結合しているものである,上記1乃至27のいずれかの製造方法。
29.該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が,該軽鎖のC末端側又はN末端側に,直接又はリンカーを介して,結合しているものである,上記28の製造方法。
30.該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が,該重鎖のC末端側又はN末端側においてリンカーを介して結合しているものである,上記28の製造方法。
31.該リンカー配列が,1~50個のアミノ酸残基からなるペプチドである,上記29又は30の製造方法。
32.該リンカーが,1個のグリシン,1個のセリン,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,配列番号1のアミノ酸配列,配列番号2のアミノ酸配列,配列番号3のアミノ酸配列,配列番号4のアミノ酸配列,及びこれらのアミノ酸配列が1~10個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである,上記31の製造方法。
33.該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が,ヒトα-L-イズロニダーゼである,上記1乃至32のいずれかの製造方法。
34.該融合蛋白質における該抗体がFabであり,
該抗体の軽鎖が,配列番号22のアミノ酸配列からなり,且つ
該抗体の重鎖が,そのC末端側で,配列番号4のアミノ酸配列からなるリンカーを介して,該ヒトα-L-イズロニダーゼと結合し,それにより該融合蛋白質が配列番号27のアミノ酸配列を形成しているものである,上記33の製造方法。
35.該融合蛋白質における該抗体がFabであり,
該抗体の軽鎖が,配列番号22のアミノ酸配列からなり,且つ
該抗体の重鎖が,配列番号23のアミノ酸配列からなり,そのC末端側で,配列番号4のアミノ酸配列からなるリンカーを介して,配列番号6のアミノ酸配列からなるヒトα-L-イズロニダーゼと結合するものである,上記33の製造方法。
36.該ヒトα-L-イズロニダーゼが,配列番号6又は7のアミノ酸配列を含んでなるものである,上記33の製造方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば,中枢神経障害を伴うリソソーム病の治療剤として臨床的に用いることのできる純度にまで精製された,抗トランスフェリン受容体抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を提供することができる。特に,中枢神経障害を伴うハーラー症候群の治療剤として臨床的に用いることのできる純度にまで精製された,抗トランスフェリン受容体抗体とヒトIDUAとの融合蛋白質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
実施例4で得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品のSE-HPLCのチャートを示す図。縦軸は215 nmでの吸光度,横軸は保持時間(分)を示す。(A)はヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの単量体に由来するピーク,(B)及び(C)はヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの重合体に由来するピークをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は,抗トランスフェリン受容体抗体(抗TfR抗体)とヒトリソソーム酵素とを結合させた蛋白質の製造方法に関するものである。ここで,リソソーム酵素と結合させる抗体は,抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り,抗体の動物種等に特に制限はないが,特にヒト抗体又はヒト化抗体である。例えば,抗体は,ヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよく,またヒト抗体とヒト以外の他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体であってもよい。
(【0011】以降は省略されています)

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