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公開番号2022071423
公報種別公開特許公報(A)
公開日2022-05-16
出願番号2020180382
出願日2020-10-28
発明の名称改変シグナルペプチド
出願人花王株式会社
代理人特許業務法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/63 20060101AFI20220509BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】改変シグナルペプチド、及びそれを用いた目的タンパク質の分泌生産。
【解決手段】目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、該改変シグナルペプチドは、C末端から1~6番目のアミノ酸残基がX1X2X3X4X5X6であり、ここで、X1がG、P又はAであり、X2がG、S又はAであり、X3がP、S又はAであり、ただしX1X2X3はGGPではなく、X4がAであり、X5がS、H又はFであり、かつX6がAであって該改変シグナルペプチドのC末端に位置する、核酸コンストラクト。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項1】
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
該改変シグナルペプチドは、C末端から1~6番目のアミノ酸残基がX
1

2

3

4

5

6
であり、ここで、X
1
がG、P又はAであり、X
2
がG、S又はAであり、X
3
がP、S又はAであり、ただしX
1

2

3
はGGPではなく、X
4
がAであり、X
5
がS、H又はFであり、かつX
6
がAであって該改変シグナルペプチドのC末端に位置する、
目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクト。
続きを表示(約 920 文字)【請求項2】

1
がG、P又はAであり、X
2
がGであり、X
3
がP又はSであり、X
4
がAであり、X
5
がS又はHであり、X
6
がAである、請求項1記載の核酸コンストラクト。
【請求項3】

1

2

3

4

5

6
が、配列番号13~30のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1記載の核酸コンストラクト。
【請求項4】

1

2

3

4

5

6
が、配列番号15、25~28のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1記載の核酸コンストラクト。
【請求項5】
前記改変シグナルペプチドのC末端から7番目~N末端までの領域が、配列番号7~12のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなる、請求項1~4のいずれか1項記載の核酸コンストラクト。
【請求項6】
前記改変シグナルペプチドのC末端から7番目~N末端までの領域が、配列番号10もしくは11のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなる、請求項5記載の核酸コンストラクト。
【請求項7】
前記改変シグナルペプチドが配列番号31~35のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1記載の核酸コンストラクト。
【請求項8】
前記目的タンパク質が抗体関連分子である、請求項1~7のいずれか1項記載の核酸コンストラクト。
【請求項9】
前記抗体関連分子がFab、ScFv及びVHHからなる群より選択される、請求項8記載の核酸コンストラクト。
【請求項10】
前記抗体関連分子がVHHである、請求項8記載の核酸コンストラクト。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、改変シグナルペプチドに関する。
続きを表示(約 3,300 文字)【背景技術】
【0002】
枯草菌等のバチルス属菌は、プロテアーゼなどのタンパク質を分泌生産する機能を有することから、目的物質の微生物学的生産のための宿主として好適である。バチルス属菌における分泌性タンパク質は、シグナルペプチドを有するプレプロタンパク質として発現され、該シグナルペプチドの働きにより細胞外に分泌される。プレプロタンパク質は、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断を経て細胞外に分泌され、最終的に成熟タンパク質となる。目的タンパク質にバチルス属菌由来シグナルペプチドを連結し、細胞外に分泌生産させる技術が利用されている。例えば、バチルス・エスピーKSM-S237株由来のセルラーゼのシグナルペプチド(特許文献1)は、目的タンパク質の効率よい分泌生産のために好適なシグナルペプチドである。
【0003】
シグナルペプチドは一般的には、正電荷を持つN末端領域と、αヘリックスを形成する疎水性膜貫通領域(H領域)と、シート状の構造を有するC末端領域からなる。主にC末端領域のペプチドがシグナルペプチダーゼにより切断される。シグナルペプチドの改変がタンパク質生産性に影響することがあることが報告されている(例えば、非特許文献1)。
【0004】
低分子抗体は、製造効率、創薬デザインの容易さ、組織浸透性などの利点を有することから、抗体医薬や試薬の材料として注目されている。代表的な低分子抗体としては、Fab、一本鎖抗体(single chain antibody;scFv)、diabody、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody、VHH)などが挙げられる。従来、抗体の微生物学的生産には主に大腸菌が用いられている。一方、非特許文献2には、ブレビバチルス発現システムにより、scFvやFab、VHHを生産できたことが記載されている。非特許文献3には、Aspergillus awamoriを用いてVHHを製造したことが報告されている。非特許文献4には、細胞内及び細胞外分子シャペロンを共発現し且つ細胞壁結合型プロテアーゼWprAが不活性化された枯草菌株が、フィブリン特異的モノクローナル抗体由来のscFvを分泌生産したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
特開2000-210081号公報
【非特許文献】
【0006】
Protein Sci, 2012, 21(1):13-25
生物工学, 2017, 95(11):649-651
Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4):384-392
Appl Environ Microbiol, 2002, p.3261-3269
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、改変シグナルペプチド、及びそれを用いた目的タンパク質の分泌生産に関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様において、本発明は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドの上流に連結された改変シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、
該改変シグナルペプチドは、C末端から1~6番目のアミノ酸残基がX
1

2

3

4

5

6
であり、ここで、X
1
がG、P又はAであり、X
2
がG、S又はAであり、X
3
がP、S又はAであり、ただしX
1

2

3
はGGPではなく、X
4
がAであり、X
5
がS、H又はFであり、かつX
6
がAであって該改変シグナルペプチドのC末端に位置する、
目的タンパク質の発現及び細胞外への分泌のための核酸コンストラクト、を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
別の一態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトを含む組換えバチルス属菌を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、前記組換えバチルス属菌を培養すること、及び、
細胞外に分泌された目的タンパク質を回収すること、
を含む、目的タンパク質の製造方法を提供する。
さらなる一態様において、本発明は、本発明の改変シグナルペプチドと、そのC末端側に連結された抗体関連分子をコードするポリペプチドとを含み、
該改変シグナルペプチドは、C末端から1~6番目のアミノ酸残基がX
1

2

3

4

5

6
であり、ここで、X
1
がG、P又はAであり、X
2
がG、S又はAであり、X
3
がP、S又はAであり、ただしX
1

2

3
はGGPではなく、X
4
がAであり、X
5
がS、H又はFであり、かつX
6
がAであって該改変シグナルペプチドのC末端に位置し、かつ、
該改変シグナルペプチドのC末端から7番目~N末端までのアミノ酸配列が、配列番号7~12のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなる、
抗体関連分子のプレプロタンパク質、を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明により提供される改変シグナルペプチドは、目的タンパク質の分泌生産に有用である。該改変シグナルペプチドは、抗体関連分子などの目的タンパク質を効率よく細胞外に分泌させ、高収量で生産することを可能にする。また該改変シグナルペプチドを用いて分泌された抗体関連分子は、N末端にシグナルペプチドの残基などの不要な残基が残存することがほとんどないので、各種医薬や試薬の原料として価値が高い。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書において、「抗体関連分子」とは、イムノグロブリン、又はイムノグロブリンを構成するドメインから選択される単一のドメインもしくは2以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。イムノグロブリンを構成するドメインとしては、イムノグロブリン重鎖のドメインであるVH、CH1、CH2及びCH3、ならびにイムノグロブリン軽鎖のドメインであるVL及びCLが挙げられる。抗体関連分子は、単量体タンパク質であってもよく、又は多量体タンパク質であってもよい。抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、又は2種類以上のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。好ましくは、抗体関連分子は、イムノグロブリンの抗原認識ドメインを含みタンパク質等の標的に特異的に結合可能な分子である。抗体関連分子の例としては、IgGなどのイムノグロブリン、ならびにFab、F(ab’)
2
、一本鎖抗体(single chain antibody、scFv)、diabody、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody、VHH)、などの低分子抗体が挙げられる。
(【0011】以降は省略されています)

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