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公開番号2022041064
公報種別公開特許公報(A)
公開日2022-03-11
出願番号2020146078
出願日2020-08-31
発明の名称α-アミラーゼ変異体
出願人花王株式会社
代理人特許業務法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/56 20060101AFI20220304BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】低温で高いデンプン分解活性を発揮するα-アミラーゼの提供。
【解決手段】配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記1)及び/又は2)で示される位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、α-アミラーゼ変異体。
1)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(a)303位若しくはこれに相当する位置、並びに(b)295位、296位及びこれらに相当する位置からなる群より選択される1以上の位置
2)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(c)331位若しくはこれに相当する位置
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項1】
配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記1)及び/又は2)で示される位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、α-アミラーゼ変異体。
1)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(a)303位若しくはこれに相当する位置、並びに(b)295位、296位及びこれらに相当する位置からなる群より選択される1以上の位置
2)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(c)331位若しくはこれに相当する位置
続きを表示(約 1,000 文字)【請求項2】
前記1)(a)で示される位置のアミノ酸残基の置換が、A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、S、T又はVへの置換であり、前記1)(b)で示される位置のアミノ酸残基の置換が、(b-1)295位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基のQ、E、G、H、L、M、S、T又はVへの置換及び(b-2)296位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基のYへの置換、のいずれか一方又は両方の置換であり、前記1)(c)で示される位置のアミノ酸残基の置換が、Sへの置換である、請求項1に記載の変異体。
【請求項3】
アミノ酸残基の置換が、下記(i)~(v)のいずれかのアミノ酸残基における置換である、請求項1又は2に記載の変異体。
(i)295位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基及び303位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基
(ii)295位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、296位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基及び303位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基
(iii)331位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基
(iv)295位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、303位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基及び331位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基
(v)295位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、296位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基、303位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基及び331位若しくはこれに相当する位置のアミノ酸残基
【請求項4】
請求項1~3のいずれか1項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
【請求項6】
請求項5に記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
【請求項7】
微生物である、請求項6に記載の形質転換細胞。
【請求項8】
請求項1~3のいずれか1項に記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
【請求項9】
衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項8に記載の洗浄剤組成物。
【請求項10】
低温で使用される、請求項9に記載の洗浄剤組成物。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、α-アミラーゼ変異体に関する。
続きを表示(約 2,400 文字)【背景技術】
【0002】
α-アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。
【0003】
洗浄剤用として有用なα-アミラーゼとしては、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-1378(FERM BP-3048)株由来のα-アミラーゼAP1378(特許文献1)、バチルス リケニフォルミス由来のα-アミラーゼであるターマミルやデュラミル(登録商標)の他、バチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM12649株由来のα-アミラーゼAA560(特許文献2)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)SP722株由来のα-アミラーゼSP722(特許文献3の配列番号4)等のバチルス属細菌由来のα-アミラーゼが知られている。また、サイトファーガ属由来のα-アミラーゼCspAmy2(特許文献4)等も知られている。
【0004】
近年では、環境保護や洗浄コスト軽減の観点から、食器洗浄や洗濯洗浄、特にランドリーでの洗濯洗浄の際の温度を下げることが重要とされ、また洗浄時間の短縮化も望まれている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常設定される温度よりも高く、このため、多くのデンプン質の汚れは完全に除去することが困難となっている。
したがって、低温においても、洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα-アミラーゼを見出すことが重要である。
低温でのα-アミラーゼの洗浄性能は、デンプンに対するアミラーゼの結合性(デンプン吸着性)と逆相関し、デンプン吸着性の低いアミラーゼが低温での洗浄性能が高いことが報告されている(特許文献5)。そして、特許文献5では、デンプン吸着性は既知のデンプン結合残基及びその隣接残基に変異を導入することで低減できることが開示されている。
【0005】
なお、CspAmy2については、これを親酵素とした変異体が作出されているが(特許文献4及び6)、低温で十分にデンプン分解活性が向上した変異体については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
国際公開第94/26881号
国際公開第00/60060号
国際公開第06/002643号
国際公開第2014/164777号
特表2014-520517号公報
特表2019-500058号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
低温において既存の洗浄用α-アミラーゼと比較して高い洗浄力を示すα-アミラーゼを開発するには、低温におけるデンプン分解活性の維持、及び低いデンプン吸着性の2点が特に重要であると考えられるが、一方で、低温におけるデンプン分解活性の維持は容易ではない。従来、既存のいかなる洗剤用途アミラーゼも、活性の強さが選抜指標の一部であったと考えられるにもかかわらず、低温におけるデンプン分解活性を十分に維持していない。
したがって、低温において既存の洗浄用アミラーゼと比較して高い洗浄力を示すアミラーゼを開発するには、低温で高いデンプン分解活性を保持するα-アミラーゼを新たに見出すことが重要である。しかしながら、既存のα-アミラーゼよりも低温で高いデンプン分解活性を保持するα-アミラーゼを選抜する配列上の指標などは存在せず、その探索は容易ではない。
本発明は、低温でのデンプン分解活性が向上したα-アミラーゼ変異体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、バチルス属細菌由来の既存のα-アミラーゼ及びNCBIタンパク質配列データベースに含まれる推定α-アミラーゼ配列の中から見出されたバチルス コリエンシス(Bacillus koreensis)由来のα-アミラーゼについて、20℃という低温でのデンプン分解活性を測定したところ、当該バチルス コリエンシス由来のα-アミラーゼが良好なデンプン分解活性を有すること、当該バチルス コリエンシス由来のα-アミラーゼの特定の変異体が低温で高いデンプン分解活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
(1)配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記1)及び/又は2)で示される位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、α-アミラーゼ変異体。
1)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(a)303位若しくはこれに相当する位置、並びに(b)295位、296位及びこれらに相当する位置からなる群より選択される1以上の位置
2)配列番号2で示されるアミノ酸配列の(c)331位若しくはこれに相当する位置
(2)(1)の変異体をコードするポリヌクレオチド。
(3)(2)のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
(4)(3)のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
(5)(1)の変異体を含む洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【0010】
本発明のα-アミラーゼ変異体は、親α-アミラーゼと比して低温でのデンプン分解活性が向上しており、低温洗浄に使用した場合でも優れたデンプン汚れ除去を可能にする。
【図面の簡単な説明】
(【0011】以降は省略されています)

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