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公開番号2021191232
公報種別公開特許公報(A)
公開日20211216
出願番号2018150454
出願日20180809
発明の名称ウイルス様粒子の精製法
出願人昭和電工株式会社
代理人
主分類C12N 7/02 20060101AFI20211119BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】医薬品等の原料として有用なエンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法に関して、工業的に有用で、効率的であり、しかも精製の結果、得られるエンベロープ型ウイルス様粒子は、高い活性を有する精製方法を提供する。
【解決手段】カチオン交換基が固定されたモノリス型カラムに、エンベロープ型ウイルス様粒子を含む液を通液してエンベロープ型ウイルス用粒子をカラムに吸着させる工程、および該カラムに吸着したエンベロープ型ウイルス様粒子を選択的に溶出させる工程を含むエンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項1】
カチオン交換基が固定されたモノリス型カラムに、エンベロープ型ウイルス様粒子を含む液を通液してエンベロープ型ウイルス用粒子をカラムに吸着させる工程、および該カラムに吸着したエンベロープ型ウイルス様粒子を選択的に溶出させる工程を含むエンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法。
続きを表示(約 610 文字)【請求項2】
エンベロープ型ウイルス様粒子を含む液のpHが、エンベロープに挿入されているタンパク質のエンベロープの外側領域の等電点より高く、pH10.0以下である、請求項1に記載の精製法。
【請求項3】
モノリス型カラムが、モノマー単体として少なくとも、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートを含む共重合体にカチオン交換基が固定されたモノリス型担体から構成されるモノリス型カラムである、請求項1あるいは2に記載の精製方法。
【請求項4】
カチオン交換基がスルホン酸基である、請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
【請求項5】
エンベロープ型ウイルス様粒子が、動的光散乱法による粒度分布の体積分布が10nm以上500nm以下であるエンベロープ型ウイルス様粒子である、請求項1〜4のいずれかに記載の精製方法。
【請求項6】
エンベロープ型ウイルス様粒子に挿入されているタンパク質がB型肝炎ウイルス抗原(HBsAg)を含む請求項1〜5のいずれかに記載の精製方法。
【請求項7】
エンベロープ型ウイルス様粒子が酵母細胞により調整されたものである、請求項1〜請求項6のいずれかに記載の精製方法。
【請求項8】
前記モノリス型カラムの厚さが、1〜100mmである請求項1〜7のいずれかに記載の精製方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、エンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法に関する。
続きを表示(約 1,600 文字)【背景技術】
【0002】
近年、バイオ医薬品の市場が拡大している。バイオ医薬品に用いられる医薬用タンパク質は、夾雑物を多量に含む細胞培養液から高度に精製される必要がある。このため、クロマトグラフィーや超遠心等の方法が一般に用いられている。医薬用タンパク質の代表として、抗体医薬品がよく知られている。抗体医薬品として、抗体の基本骨格をベースとした動物細胞での発現量向上の研究が広く為され、さらには抗体の基本骨格をベースとした精製プロセスが盛んに研究されてきた。
【0003】
バイオ医薬品において、ウイルス様粒子(VLP:virus−like particles)を医療分野で治療に用いる方法が急速に拡大している。例えば、新たなワクチンとしての応用やウイルスベクター・ドラッグデリバリー担体としての遺伝子治療等である。ウイルス様粒子の市場は、今後さらに拡大していくことが期待されている。
【0004】
一般に、ウイルス様粒子は細菌細胞や酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、ヒトを含む動物由来の細胞株を用いた細胞培養によって生産される。ウイルス様粒子はウイルスの特有な外殻構造を模倣して構築される。ウイルス様粒子は、ウイルス種に応じて異なる性状を有する。このため、共通の骨格と言えるものはなく、個々の発現量向上や精製プロセスの研究が必要である。
【0005】
ウイルス様粒子は、凝集物に加えて、構造の不安定さから、分解物や、完全な構造を有さない物も発生し、不純物となることがある。それらの不純物は、薬効の低下や免疫原性の発現等、医薬品にとって有害な影響をもたらすことが懸念されている。そのため、有害な影響がなくなる程度まで、不純物が除去されることが望まれている。
【0006】
ウイルス様粒子における、不純物の除去には、超遠心による精製法が研究されている。しかし超遠心精製手法は、生産効率が悪かった。生産効率の向上を目的として、クロマトグラフィーによる精製方法が多数報告されている。これらは、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を単独もしくは複合して用いる、あるいはそれらを混合した混合モードクロマトグラフィーを用いる等により精製するものである。
【0007】
ウイルス様粒子の内、エンベロープ型ウイルス様粒子は、一般的にはリン脂質膜にタンパク質が挿入された構造を取る。一般的には、その脂質膜とクロマトグラフィー担体との疎水的相互作用を利用し、培養液中に多量に含まれる夾雑物との分離を行う。
【0008】
エンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法についても多数報告されている。例えば非特許文献1では、様々なイオン交換基が固定された粒子状の多孔質高分子担体と様々な溶離液pHを組み合わせたプロセスにおける結合容量の比較が記載されている。文献1によると、カチオン交換基が固定された粒子状の多孔質高分子担体よりもアニオン交換基が固定された粒子状の多孔質高分子担体の方が、広いpH範囲で、結合容量が高く、優れた濃縮・精製が可能であることが記載されている。
【0009】
また、非特許文献2では、硫酸エステル基が固定された多孔質高分子担体からなる充填剤を用いたカラムによるエンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法が記載されている。
【0010】
さらに、非特許文献3には、疎水性の表面を有するモノリス型カラム、あるいはブチル基が固定された粒子状の多孔質高分子担体からなるカラムを用いたエンベロープ型ウイルス様粒子の精製方法が記載されている。本方法では、混入する脂質による、カラムの閉塞や汚染を防ぐために適切な前処理や洗浄方法が必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
(【0011】以降は省略されています)

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