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公開番号2020193883
公報種別公開特許公報(A)
公開日20201203
出願番号2019099972
出願日20190529
発明の名称光計測装置
出願人株式会社日立製作所
代理人特許業務法人平木国際特許事務所
主分類G01N 21/65 20060101AFI20201106BHJP(測定;試験)
要約【課題】スキャン中において浸漬媒体が減少することによって生じる信号損失を抑制しつつ、レーザスキャンシステムにおいて浸漬型対物レンズを用いることができるCARSシステムを提供する。
【解決手段】本発明に係る光計測装置200は、浸漬媒体210として用いる液体を収容する液体容器207内にサンプル容器を吊り下げ、集束レンズ206の開口部分を液体内に突出させた状態で、集束レンズを液体容器に固定する。集光レンズ211は、集束レンズが試料に対して光を照射することにより試料から生じる信号光を集光する。分光計212とカメラ213は、信号光を検出する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項1】
光を用いて試料を計測する光計測装置であって、
パルス光を出射する光源、
前記パルス光を第1光と第2光に分岐する光分岐部、
前記第1光からストークス光を生成する光学素子、
前記ストークス光を前記第2光と結合することにより照射光を生成する光結合部、
前記照射光を前記試料に対して集束する集束レンズ、
浸漬媒体として液体を収容する液体容器、
前記試料を収容するサンプル容器、
前記サンプル容器を保持するサンプルステージ、
前記照射光によって前記試料を照射したとき前記試料から生じる信号光を集光する集光レンズ、
を備え、
前記サンプルステージは、前記液体容器内の前記液体中に前記サンプル容器を保持し、
前記集光レンズは、前記液体容器内に前記液体が充填されたとき、前記集光レンズの開口部が前記液体容器内の前記液体中に浸漬されるように、前記液体容器に対して固定されている
ことを特徴とする光計測装置。
続きを表示(約 1,400 文字)【請求項2】
前記サンプル容器は、前記試料を収容する複数のウェルを備え、
前記サンプル容器は、前記集束レンズによって前記照射光が集束される位置に前記複数のウェルの何れも配置されるように前記サンプル容器が前記液体容器内で移動することができるサイズを有する
ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
【請求項3】
前記サンプル容器は、前記試料を収容するウェルを備え、
前記ウェルの深さと前記ウェルの開口サイズは、前記試料から生じた前記信号光が前記ウェルの内側面によって遮蔽されないように構成されている
ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
【請求項4】
前記サンプル容器はさらに、
前記試料を収容するウェル、
前記ウェルの上面を覆う上側プレート、
前記ウェルの下面を覆う下側プレート、
を備え、
前記ウェルは、前記上側プレートと前記下側プレートによって封止されている
ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
【請求項5】
前記サンプル容器はさらに、前記集束レンズが前記照射光を集束する位置に対して前記液体が入り込まないようにするブロック部材を備える
ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
【請求項6】
前記光計測装置はさらに、前記集束レンズの開口部と前記サンプル容器の底面との間の領域において前記液体の流れを生じさせることにより、前記領域から気泡を押し出す、液流生成部を備える
ことを特徴とする請求項1記載の光計測装置。
【請求項7】
前記液流生成部はさらに、
前記液体容器の外において前記液体を収容する第2容器、
前記第2容器から前記領域へ向けて前記液体を噴射する噴射ノズル、
前記液体が前記液体容器から出ていく液体排出口、
を備える
ことを特徴とする請求項6記載の光計測装置。
【請求項8】
光計測装置を用いて試料を計測する光計測方法であって、
前記光計測装置は、
パルス光を出射する光源、
前記パルス光を第1光と第2光に分岐する光分岐部、
前記第1光からストークス光を生成する光学素子、
前記ストークス光を前記第2光と結合することにより照射光を生成する光結合部、
前記照射光を前記試料に対して集束する集束レンズ、
浸漬媒体として液体を収容する液体容器、
前記試料を収容するサンプル容器、
前記サンプル容器を保持するサンプルステージ、
前記照射光によって前記試料を照射したとき前記試料から生じる信号光を集光する集光レンズ、
を備え、
前記サンプルステージは、前記液体容器内の前記液体中に前記サンプル容器を保持し、
前記集光レンズは、前記液体容器内に前記液体が充填されたとき、前記集光レンズの開口部が前記液体容器内の前記液体中に浸漬されるように、前記液体容器に対して固定されており、
前記光計測方法は、
前記液体容器内に前記液体を充填するステップ、
前記光計測装置を用いて前記試料に対して前記照射光を照射することにより前記試料を計測するステップ、
を有する
ことを特徴とする光計測方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、光を用いて試料を計測する光計測装置に関する。
続きを表示(約 6,300 文字)【背景技術】
【0002】
生物学的用途において、計測したい化学物質に対して蛍光ラベルやタグを付与し、蛍光計測によって対象物質の分布等を計測する手法がある。しかし、化学物質にラベルやタグを付与すると、計測対象に意図しない影響が生じる。例えば生物学的反応経路を変化させたり、競合阻害に起因して生物学的機能を阻害したりすることである。ラベルやタグはこのような作用を有するので、蛍光分光に代えてラマン分光が用いられる場合がある。ラマン分光では各分子に固有のラマンスペクトルを得ることができ、ラベルフリーかつ非侵襲・非破壊で化学種を検出できる。さらにこのラマン分光のうち近年非線形ラマン分光であるコヒーレント反ストークスラマン分光(CARS)が注目されている。
【0003】
CARSは3次非線形光学プロセスを用いる技術である。CARSのコヒーレント性により、自発ラマン散乱プロセスと比較すると信号レベルを格段に増加させることができる。信号レベルが増加することにより、CARSシステムは自発ラマンよりも高速に動作することができる。
【0004】
CARSシステムでは位相整合と呼ばれる制約条件を緩和するために、高開口数(NA)対物レンズがしばしば用いられる。また高いNAの対物レンズを用いることで計測の空間分解能も向上する。高NA対物レンズの一部では、NAを向上させるため浸漬媒体を用いる。しかし、これら液浸対物レンズは、化学的および生物学的スクリーニング用途等に使われるウェルプレートを用いた計測に使用する際に問題がある。
【0005】
ウェルプレートでは各ウェルにサンプルが注入され、各ウェルをスキャンしながら計測を行うこととなる。しかし浸漬型対物レンズを用いると、サンプルをスキャンした場合に浸漬媒体が対物レンズ上に留まることができない。これはウェルプレートが移動する際、ウェルプレート底面に液浸媒体が付着し、対物レンズとウェルプレートの間から抜けてしまうためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
WO2005/078503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記のように位相整合条件を緩和するため、CARSシステムにおいては開口数が大きい液浸対物レンズが良く用いられる。しかしウェルプレートに注入されたサンプルをスキャンニングにより計測する際には、先に述べた通り浸漬媒体の減少に対処しなければならない。
【0008】
特許文献1は、スキャンシステムにおける液浸レンズの課題を取り扱っている。同文献は、対物レンズに取り付けたチューブを用いて、レンズに対して浸漬媒体を継続的に供給する。しかし同文献記載の手法は、浸漬媒体の流速に応じてスループットが低下する可能性がある。また同文献記載の手法は、浸漬媒体を供給制御する機構(浸漬媒体を搬送するチューブなど)を配置する必要があるので、システムの複雑度が増す。
【0009】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、スキャン中において浸漬媒体が減少することによって生じる信号損失を抑制しつつ、レーザスキャンシステムにおいて浸漬型対物レンズを用いることができるCARSシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明に係る光計測装置は、浸漬媒体として用いる液体を収容する液体容器内にサンプル容器を吊り下げ、集束レンズの開口部分を液体内に突出させた状態で、集束レンズを液体容器に固定する。
【発明の効果】
【0011】
本発明に係る光計測装置は、浸漬媒体を収容する液体容器に対物レンズを固定してサンプル容器をスキャンすることにより、浸漬媒体を損なうことなく、照射光の照射位置をスキャンすることができる。上記した以外の課題、構成、および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
CARSプロセスのエネルギー図である。
実施形態1に係る光計測装置200の構成図である。
集束レンズ206の周辺を拡大した図である。
スキャンデバイス209の周辺構成を示す図である。
スキャンデバイス209がサンプル容器301の位置をスキャンする様子を示す、サンプル容器301の上面図である。
光計測装置200が試料から信号光を取得する手順を説明するフローチャートである。
S604の詳細手順を示す図である。
背景ノイズスペクトルの1例である。
信号光スペクトルの1例である。
S604によって得たスペクトルの1例である。
実施形態2に係る光計測装置200が備えるウェル208の側面模式図である。
実施形態3におけるサンプル容器301の構成図である。
実施形態4に係るサンプル容器301の構成を示す側面図である。
実施形態5に係る光計測装置200の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
<実施の形態1>
図1は、CARSプロセスのエネルギー図である。CARSプロセスは、ポンプ光、ストークス光、プローブ光がサンプルと相互作用してアンチストークス光が生成される4光波混合プロセスである。ポンプ光とストークス光がラマン活性準位と一致するエネルギー差を有すると、分子振動がコヒーレントに駆動され、増幅されたアンチストークス光が得られる。
【0014】
CARS信号は、自発ラマン散乱プロセスと比較して信号強度が増加することに加えて、信号光の波長が短波長側にシフトするので、蛍光信号から分離することができる。蛍光信号は、ラマン分光におけるノイズ源となるものである。
【0015】
図2は、本発明の実施形態1に係る光計測装置200の構成図である。光計測装置200は、ウェルプレートに注入されたサンプルをCARSにより計測する装置である。光計測装置200は、後述する液浸型の集束レンズを用いて、試料に対して光を照射する。
【0016】
光源201が出射したパルス光は、ファイバ202と203へそれぞれ入射するように分岐される(第1光と第2光)。ファイバ203は、光源201が出射した光を用いてスーパーコンティニュウム光(500〜3500cm
−1
)を生成する。スーパーコンティニュウム光は遅延ライン204に入射する。遅延ライン204は、ファイバ202を通過する光とパルスのタイミングが合致するように、パルス遅延を調整するためのものである。ファイバ202はシングルモードファイバである。光結合部205(例えばダイクロイックミラー)は、ファイバ202を通過した光とファイバ203を通過した光を結合する。結合光は、集束レンズ206によって試料に対してプローブ光として集束される。集光レンズ211は、集束レンズ206が試料に対して光を照射することにより試料から生じる信号光を集光する。分光計212とカメラ213は、信号光を検出する。以上の構成により、図1に例示するCARS光を用いた光計測が実施される。その他部材については後述する。
【0017】
図3は、集束レンズ206の周辺を拡大した図である。液体容器207内には、浸漬媒体210(例えば水)が収容されている。集束レンズ206は、液体容器207の底面に取り付けられて固定されている。集束レンズ206の開口部は、液体容器207の底面から上方に向けて突出している。したがって液体容器207内に浸漬媒体210が充填されている間は、開口部に対して浸漬媒体210が常時供給される。サンプル容器301は、試料を収容する容器である。サンプル容器301はウェル208を有し、ウェル208内に試料が収容される。集束レンズ206はウェル208内の試料に対して光を照射し、集光レンズ211は試料から生じる信号光を集光する。
【0018】
図4は、スキャンデバイス209の周辺構成を示す図である。サンプル容器301はアーム214を介してスキャンデバイス209と接続されている。スキャンデバイス209とアーム214は、サンプル容器301が液体容器207内(すなわち浸漬媒体210内)に吊り下げられるようにして、サンプル容器301を保持する。スキャンデバイス209は、以下の手順にしたがってサンプル容器301の位置を走査する。
【0019】
スキャンデバイス209はまず、サンプル容器301を垂直方向に移動させることにより、焦点深度を調整する。スキャンデバイス209は次に、計測する試料を収容しているウェル208に対して照射光が照射されるように、サンプル容器301を水平方向に移動させる。スキャンデバイス209は、各ウェル208に対してそれぞれ照射光が照射されるように、サンプル容器301を順次移動させる。サンプル容器301の走査手順の例については後述する。これにより全てのウェル208内の試料に対して照射光が照射され、各試料からCARS光が生成される。
【0020】
図5は、スキャンデバイス209がサンプル容器301の位置をスキャンする様子の例を示す、サンプル容器301の上面図である。図5においては、液体容器207の略中央位置に集束レンズ206が取り付けられており(図示は省略)、照射光はこれに対応する照射位置501に集束される。スキャンデバイス209は例えば、まず図5の左上端部に配置されているウェル208に対して照射光が集束されるように、サンプル容器301を移動させる。スキャンデバイス209は次に、図5の右方向に向かってサンプル容器301を移動させることにより、図5の横方向に向かって各ウェル208を順次スキャンする。右端のウェル208に対する計測が完了すると1つ下の行を同様にスキャンする。以下同様にサンプル容器301を移動させることにより、全てのウェル208をスキャンする。
【0021】
サンプル容器301の平面サイズは、全てのウェル208内の試料に対して照射光を照射できるように構成されている必要がある。例えばサンプル容器301が液体容器207に対して大きすぎると、全てのウェル208の位置を照射位置501と合わせることができない。換言すると、全てのウェル208に対して集束レンズ206から光を照射するために必要な余白部分が不足する。したがってサンプル容器301の平面サイズは、液体容器207の液体収容部分の平面サイズと照射位置501に応じて適切に定める必要がある。さらにはサンプル容器301上における各ウェル208の位置を考慮して、全てのウェル208に対して照射光が集束されるようにする必要がある。
【0022】
スキャンデバイス209がサンプル容器301を移動させる速度は、試料種別、計測所要時間、信号光を取得するために必要な所要時間(同じウェル208に対して照射光を照射する時間)、などに応じて定めることができる。これらが変更された場合は、それに応じて移動速度を調整すればよい。
【0023】
サンプル容器301の位置を走査する過程において、ウェル208内の試料から生じる信号光を検出するとともに、背景ノイズを検出することができる。走査位置をウェル208間で移動させている間において集光レンズ211が取得する光が、背景ノイズに相当する。信号光と背景ノイズの例については後述する。
【0024】
図6は、光計測装置200が試料から信号光を取得する手順を説明するフローチャートである。以下図6の各ステップについて説明する。
【0025】
(図6:ステップS601〜S603)
ユーザは液体容器207内に浸漬媒体210を充填する(S601)。ユーザはサンプル容器301をアーム214に取り付ける(S602)。ユーザはスキャンデバイス209によってサンプル容器301のZ方向位置を調整することにより、集束レンズ206の焦点深度を調整する(S603)。
【0026】
(図6:ステップS604)
光源201から光を照射し、図2で説明した光学系にしたがって、集束レンズ206は照射光を照射位置501に対して照射する。照射位置501に配置されているウェル208内の試料から信号光が生じる。集光レンズ211は信号光を取得し、分光計212は信号光の信号スペクトルを取得する。信号スペクトルを取得する手順の具体例については後述する。
【0027】
(図6:ステップS605〜S606)
X方向(図5における横方向)における位置スキャンを完了した場合はステップS607へ進む。完了していない場合、スキャンデバイス209は、X方向の隣接するウェル208に対して照射位置501を合わせるように、サンプル容器301を移動させ(S606)、S604に戻って同様に信号スペクトルを取得する。
【0028】
(図6:ステップS607〜S608)
Y方向(図5における縦方向)における位置スキャンを完了した場合は本フローチャートを終了する。完了していない場合、スキャンデバイス209は、Y方向の隣接するウェル208に対して照射位置501を合わせるように、サンプル容器301を移動させ(S608)、S604に戻って同様に信号スペクトルを取得する。
【0029】
図7は、S604の詳細手順を示す図である。分光計212は、以下の信号スペクトルを取得する:(a)1つのウェル208が収容している試料の信号光のスペクトル;(b)背景ノイズの信号スペクトル;(c)ダークスペクトル(何もない部分において取得した信号スペクトル)(501)。分光計212は、各スペクトルを時間平均する(502)。分光計212は、サンプル信号スペクトルからダークスペクトルを減算するとともに、背景ノイズスペクトルからダークスペクトルを減算する(503)。これによりレーザに起因するノイズを除去することができる。分光計212は、サンプル信号光スペクトルを背景ノイズスペクトルによって除算することにより、信号レベルを正規化する(504)。分光計212は、信号光スペクトルに対してフィルタリングを実施する(505)。例えばSavitzky−Golayフィルタ、ウィナーフィルタ、ローパスフィルタ、IIR(無間インパルス応答)フィルタ、などを用いることができる。分光計212は以上の手順により試料の計測結果を得ることができる。
【0030】
図8〜図10は、それぞれ背景ノイズスペクトルの1例(図8)、信号光スペクトルの1例(図9)、S604によって得たスペクトルの1例(図10)である。
(【0031】以降は省略されています)

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