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公開番号2024058679
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-26
出願番号2022165180
出願日2022-10-14
発明の名称リシール細胞セット及びその製造方法
出願人国立大学法人東京工業大学,国立大学法人東京大学
代理人個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20240418BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明の目的は、疾患(例えば糖尿病)の病態の解析のための効率的なモデル細胞を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明の2つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、リシール細胞、及びその製造方法によって解決することができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、リシール細胞。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である請求項１に記載のリシール細胞。
【請求項３】
２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、２つ又は３つ以上のリシール細胞セットであって、前記２つ又は３つ以上のリシール細胞における外来性細胞質の比率が異なる、前記細胞セット。
【請求項４】
前記２つの異なる細胞の、一方の細胞の細胞質のみを含むリシール細胞、及び／又は他方の細胞の細胞質のみを含むリシール細胞を更に含む、請求項３に記載の細胞セット。
【請求項５】
前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である、請求項４に記載の細胞セット。
【請求項６】
請求項２に記載のリシール細胞、又は請求項５に記載の細胞セットを分析することを特徴とする、生命現象の解析方法。
【請求項７】
請求項２に記載のリシール細胞、又は請求項５に記載の細胞セットに、疾患の治療又は予防用候補物質を接触させることを特徴とする、治療又は予防用化合物のスクリーニング方法。
【請求項８】
（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、
（ｂ）２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合物を添加し、インキュベートする工程、及び
（ｃ）カルシウムイオンを添加し、インキュベートする工程、
を含む、リシール細胞の製造方法。
【請求項９】
前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である、請求項８に記載のリシール細胞の製造方法。
【請求項１０】
（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、
（ｂ）２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合物及びＡＴＰを添加し、インキュベートする工程、及び
（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程、
を含み、前記（ｂ）工程において、２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合比率の異なる２つ又は３つ以上の混合物を用い、２つ又は３つ以上のリシール細胞のセットを調製する、リシール細胞セットの製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リシール細胞セット及びその製造方法に関する。本発明によれば、例えば、疾患細胞の病態を、簡便に解析することができる。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
セミインタクト細胞リシール技術は、コレステロール依存性の膜穿孔活性を持つタンパク質毒素を利用することによって細胞膜に孔を形成させ、そして膜不透過性の化合物、生体分子、又は細胞質成分などを細胞内に導入し、その後、カルシウム依存的に、細胞膜の孔を封入し、リシール細胞を作製する技術である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
「サイエンティフィック・リポート（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ）」（英国）２０１７年、第７巻、ｐ１－１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、セミインタクト細胞リシール技術を用いて、正常細胞又は糖尿病細胞の細胞質をリシール細胞に封入し、正常細胞又は糖尿病細胞のモデル細胞を作製した（非特許文献１）。しかしながら、糖尿病の病態の解析を行うことは容易ではなかった。
本発明の目的は、疾患（例えば糖尿病）の病態の解析のための効率的なモデル細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、疾患の病態の解析のための効率的なモデル細胞について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、セミインタクト細胞リシール技術により、２つの異なる細胞（例えば、疾患細胞と正常細胞）の細胞質の混合物をリシール細胞に封入することにより、容易に疾患の病態解析のための優れたモデル細胞を作製できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、リシール細胞、
［２］前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である［１］に記載のリシール細胞、
［３］２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、２つ又は３つ以上のリシール細胞セットであって、前記２つ又は３つ以上のリシール細胞における外来性細胞質の比率が異なる、前記細胞セット、
［４］前記２つの異なる細胞の、一方の細胞の細胞質のみを含むリシール細胞、及び／又は他方の細胞の細胞質のみを含むリシール細胞を更に含む、［３］に記載の細胞セット、
［５］前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である、［３］又は［４］に記載の細胞セット、
［６］［２］に記載のリシール細胞、又は［５］に記載の細胞セットを分析することを特徴とする、生命現象の解析方法、
［７］［２］に記載のリシール細胞、又は［５］に記載の細胞セットに、疾患の治療又は予防用候補物質を接触させることを特徴とする、治療又は予防用化合物のスクリーニング方法、
［８］（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、（ｂ）２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合物を添加し、インキュベートする工程、及び（ｃ）カルシウムイオンを添加し、インキュベートする工程、を含む、リシール細胞の製造方法、
［９］前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である、［８］に記載のリシール細胞の製造方法、
［１０］（ａ）細胞を含む培地に穿孔活性を持つ生物毒素を添加し、インキュベートする工程、（ｂ）２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合物及びＡＴＰを添加し、インキュベートする工程、及び（ｃ）カルシウムイオンを含む培地を添加し、インキュベートする工程、を含み、前記（ｂ）工程において、２つの異なる細胞の外来性細胞質の混合比率の異なる２つ又は３つ以上の混合物を用い、２つ又は３つ以上のリシール細胞のセットを調製する、リシール細胞セットの製造方法、及び
［１１］前記２つの異なる細胞が、正常細胞及び疾患由来細胞、又は若齢細胞及び老齢細胞である、［１０］に記載のリシール細胞セットの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のリシール細胞によれば、容易に疾患の病態を解析することができる。また、疾患の病態の時間的経過を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
２つの異なる細胞（Ａ細胞及びＢ細胞）の細胞質を用い、５つのリシール細胞のセットを作製した場合の模式図である。
２つの異なる細胞の細胞質を、不連続の混合比率でセミインタクト細胞に封入する実施態様（Ａ）、及び連続した混合比率でセミインタクト細胞に封入する実施態様（Ｂ）を示した図である。
図３Ａは、インスリン刺激後３０分後に固定した病態進行モデル細胞系列において、２０種類のタンパク質の核、細胞質、細胞全体でのこれらのタンパク質の変化するパターンを解析した結果である。図３Ａの右の図は、インタクト細胞をインスリン刺激してからの６０分間の細胞内蛋白質の時間的同調性を、ＰＬＯＭ－ＣＯＮ解析法により解析した図である。図３Ｂは、解析対象とするタンパク質の単一細胞内の「タンパク質量」を「特徴量」として、横軸を「病態進行過程」と考えて、バイオマーカーの探索を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］リシール細胞セット
本発明のリシール細胞セットは、２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む、少なくとも１つのリシール細胞を含む。
【０００９】
《リシール細胞》
本発明のリシール細胞は、２つの異なる細胞の外来性細胞質を含む。本明細書において、「リシール細胞」とは、セミインタクト細胞リシール技術を用いて作製された細胞を意味する。具体的には、ストレプトリシン０などの蛋白質毒素の細胞膜穿孔活性を利用して細胞膜を穿孔し、細胞質を流失させた細胞（以下、セミインタクト細胞と称することがある）に、他の細胞又は組織等から調製した外来性細胞質を添加及び導入する。その後、Ｃａ
２＋
と細胞質因子依存的に、セミインタクト細胞の細胞膜にできた孔を閉鎖することによって作製される細胞である。限定されるものではないが、本発明のリシール細胞は、後述の「リシール細胞の製造方法」によって作製することができる。
【００１０】
前記２つの異なる細胞は、特に限定されないが、例えば正常細胞及び疾患由来細胞、若齢細胞及び老齢細胞、又は前駆体細胞及び分化細胞が挙げられる。
（【００１１】以降は省略されています）

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